小鼠阴道上皮类器官与 CD8 T 细胞共培养诱导驻留记忆 T 细胞分化的实验方案

驻留记忆 T 细胞(TRM)在黏膜组织中的稳定建立是提升免疫治疗效果与疫苗保护力的关键，但 TRM 形成的调控机制尚未完全明确。传统体外模型难以模拟体内黏膜微环境，无法有效诱导功能性 TRM。本研究建立小鼠阴道上皮类器官(VEOs)与 CD8 T 细胞的共培养体系，作为简化模型解决体外模拟黏膜 TRM 分化的技术缺口，为探究 TRM 形成机制及开发相关免疫策略提供可靠实验方案。

来自美国布朗大学分子微生物学与免疫学系的团队在《STAR Protocols》(2025 年，Vol. 6)发表题为Protocol for the coculture of murine vaginal epithelial organoids and T cells to induce resident memory CD8 T cell differentiation的研究。

核心内容如下：

(1)研究方法

Naive CD8 T 细胞分离、富集与激活：从小鼠次级淋巴器官(脾、肠系膜 / 髂骨 / 腹股沟等淋巴结)分离细胞，用 MojoSort 试剂盒负选富集 naive CD8 T 细胞(纯度 > 95%);将细胞接种到预包被抗 CD3ε(TCR 激活)和 B7.1-Fc(共刺激)的 24 孔板，加含 IL-2(100 U/mL)、IL-12(2.5 ng/mL)的完全激活培养基，37℃、5% CO₂培养 2 天，显微镜下观察到 5-10 细胞簇即激活成功。

激活后 T 细胞静息：收集激活的 T 细胞，用含 IL-2(100 U/mL)的完全静息培养基重悬(25 万个 /mL)，接种到未包被的 24 孔板，培养 2 天，形成更大细胞簇(提升增殖与存活)。

类器官 - T 细胞共培养：取 6-9 天龄 VEOs，胰酶消化为单细胞，用含特异性抗原肽(如 OT-I T 细胞对应 SIINFEKL)的培养基孵育 1 小时(加载抗原);与静息后 T 细胞按比例混合(96 孔板：5000 上皮细胞 + 10 万 T 细胞 / 孔)，用基底膜提取物(BME)包裹形成 8μL 液滴，倒置培养 30 分钟使 BME 凝固;加含 EGF(100 ng/mL)、Y-27632(前 4 天，抑制细胞凋亡)的完全共培养培养基，每 2 天换液，共培养 7-12 天。

TRM 表型流式分析：收集共培养细胞，用 TRM 标志物抗体(CD69、CD103、PD-1、CD62L)和活死染料(Ghost Dye Red 780)染色，流式细胞仪检测， gated 活 CD45.1 + 特异性 CD8 T 细胞。

(2)关键结果

共培养 10 天后，96 孔板每孔可分离 500-2500 个 T 细胞，其中 7%-40% 为 CD69+CD103 + 经典 TRM 表型，该群体高表达 PD-1、低表达循环 T 细胞标志物 CD62L，与体内黏膜 TRM 表型一致;单独培养的 CD8 T 细胞无法诱导 TRM 表型，证实类器官微环境的必要性;共培养需去除 TGF-β 抑制剂(如 SB431542)，否则会抑制 TRM 分化;VEOs 在无抑制剂条件下生长略有减缓，但仍能支持 TRM 形成;流式结果显示，共培养组 CD69+CD103 + 细胞比例显著高于 T 细胞单独培养组，且表型稳定。

实验结果

图 1：CD8 T 细胞激活与静息的形态对比

该图验证 T 细胞激活状态：左图为激活 2 天的 T 细胞，形成 5-10 个细胞的小簇;右图为静息 2 天的 T 细胞，簇更大、细胞密度更高。比例尺 200μm。图示明确激活与静息的形态差异，为后续共培养提供合格 T 细胞的判断标准。

图 2：BME 包裹 VEO 单细胞的共培养接种过程

该图展示共培养关键步骤：(A)消化后的 VEO 单细胞 pellet;(B)24 孔板中无培养基的 20μL BME 液滴(含上皮细胞);(C)加培养基后的 BME 液滴。图示直观呈现 BME 包裹技术，确保细胞被稳定固定在液滴内，为共培养提供适宜微环境。

图 3：CD8 T 细胞 - VEO 共培养的形态与免疫荧光验证

该图证实共培养体系有效性：左图为共培养 1 天的明场图，黄色箭头示 T 细胞与上皮细胞共存;右图为 7 天共培养的免疫荧光图，EpCAM(红色)标记上皮细胞，DAPI(青色)标记所有细胞核，可见上皮结构完整，T 细胞分布于周围。图示证明共培养中细胞存活且维持结构，排除体系毒性问题。

图 4：共培养诱导 TRM 表型的流式分析结果

该图为核心功能验证：上图为 T 细胞单独培养，CD69+CD103+ TRM 比例极低;下图为共培养组，CD69+CD103 + 细胞比例显著升高，且高表达 PD-1、低表达 CD62L。细胞 gated 在活 CD45.1+ LCMV 特异性 CD8 T 细胞。图示直接证实类器官微环境可诱导功能性 TRM 分化。

全文总结

本研究建立了一套可重复的小鼠阴道上皮类器官与 CD8 T 细胞共培养 protocol，核心贡献在于：1. 明确 “激活 2 天 + 静息 2 天 + 共培养 7-12 天” 的时序，优化 BME 包裹和培养基成分(前 4 天加 Y-27632，去除 TGF-β 抑制剂)，确保 TRM 高效诱导;2. 成功诱导 CD69+CD103+PD-1+CD62Llow 经典 TRM 表型，证实类器官微环境是 TRM 形成的关键;3. 提供 troubleshooting 方案(如 BME 快速凝固用预冷枪头、液滴脱落避免直接冲击液滴)，提升实验可重复性。局限性包括：TRM 比例(7%-40%)受 T 细胞激活质量和类器官健康状态影响存在批次差异;部分黏膜类器官需 TGF-β 抑制剂维持生长，可能限制该方案应用。未来需优化类器官培养条件，拓展至肠道、肺部等其他黏膜类器官，并验证诱导 TRM 的体内保护功能。