通过 PI3K-Notch 信号调控生成近端偏向的功能性人 iPSC 肾类器官

近端小管是肾脏重吸收(糖、离子、氨基酸)的核心结构，其损伤是导致透析或移植的主要原因。iPSC 来源的肾类器官虽为肾脏研究提供平台，但近端小管分化不完全，HNF4A 等关键转录因子及功能性溶质转运体(如有机离子转运体)表达不足，难以模拟近端小管生理功能与损伤响应。体内近端小管发育依赖 Notch 信号调控 HNF1B/HNF4A 通路，而现有类器官中该通路激活不足。本研究通过模拟体内发育机制，用短暂 PI3K 抑制激活 Notch 信号，引导肾祖细胞向近端小管分化，生成 “近端偏向(PB)” 肾类器官，解决近端小管成熟度与功能不足的问题。

来自美国南加州大学干细胞生物学与再生医学系的团队在《Nature Communications》(2025 年，Vol. 16)发表题为Controlling nephron precursor differentiation to generate proximal-biased kidney organoids with emerging maturity的研究。

核心内容如下：

(1)研究方法

iPSC 培养与肾类器官诱导：采用 3 株人 iPSC(含 HNF4A-YFP 报告株)，按改良 Takasato 协议诱导：iPSC 经 CHIR99021(Wnt 激活)处理 5 天，FGF9 + 肝素处理 2 天;7 天时细胞聚集为类器官，对照组用常规培养基，近端偏向(PB)组在 10-12 天加 10μM PI3K 抑制剂 LY294002，后续用 TeSR-E6 培养至 27 天。

分子与功能检测：通过单细胞 / 单细胞核 RNA-seq 分析转录组(检测 HNF4A、SLC 家族转运体等);免疫荧光验证近端标志物(HNF4A、LRP2、LTL)、紧密连接(ZO-1)及损伤标志物(HAVCR1/KIM1、γH2AX);功能实验用荧光标记白蛋白 / 葡聚糖检测近端小管摄取能力;顺铂(5μM，2 次给药)处理模拟近端小管损伤，检测损伤响应。

对照与模型对比：设置无 PI3K 抑制对照组、Notch 抑制剂(DAPT)处理组，验证信号通路依赖性;与近端小管增强型(PT-E)类器官对比，评估近端小管纯度与成熟度。

(2)关键结果

常规类器官存在近端发育异常，HNF4A 及下游溶质转运体(如 SLC22A2/OCT2、SLC22A6/OAT1)表达低，且早期出现 HNF1B+/JAG1+/WT1 + 三阳性异常细胞;PB 组(10-12 天 LY294002 处理)通过抑制 PI3K 激活 Notch 信号，JAG1、HES1 表达升高，HNF1B 上调 2.88 倍，18 天时 HNF4A + 细胞比例达 10.14%(对照组 3.78%)，且分布从类器官边缘扩展至中心;PB 类器官高表达近端功能性转运体(83.3% 有机阳离子转运体、62.5% 有机阴离子转运体)，白蛋白摄取量提升 2.92 倍、葡聚糖摄取提升 1.61 倍，具备近端小管生理功能;顺铂处理后，PB 类器官 HNF4A + 细胞中 HAVCR1 表达显著升高(1.56 倍)，伴随管状结构坍塌、γH2AX(DNA 损伤)增加、SOX9(损伤修复标志物)上调，模拟体内近端小管损伤响应;与 PT-E 类器官相比，PB 类器官远端小管(TFAP2A+)与间质细胞更少，近端纯度更高，且无软骨等异位细胞。

实验结果

图 1：体内外近端肾单位发育的形态与转录对比

该图对比人类胚胎肾脏与常规类器官的近端发育差异：(A-B)体内发育：肾小囊→逗号体→S 形体→毛细血管袢期(CLSN)，HNF1B/JAG1 逐步向近端扩展，HNF4A 在 S 形体 medial 区出现，CLSN 期形成 HNF4A 高表达的近端小管;(C-F)常规类器官：11-12 天呈 HNF1B+/JAG1+/WT1 + 三阳性均一状态，无近端 - 远端轴分化，18 天 HNF4A + 细胞少且 JAG1 持续高表达;(G-H)基因富集分析：PB 组(LY29 处理)PI3K 通路下调、Notch 通路上调，JAG1、HNF1B 显著升高。图示明确常规类器官的发育缺陷，为 PI3K 抑制干预提供依据。

图 2：PI3K 抑制引导类器官向近端小管命运转变

该图验证 PI3K 抑制的作用：(A)单细胞 UMAP：10 天为肾祖细胞(SIX1+)，12 天对照组偏向足细胞(PODXL+)，PB 组偏向上皮小管(HNF1B+/CDH4+);(B-E)差异表达基因：PB 组上皮标志物(CDH4、LHX1)、Notch 配体(JAG1、DLL1)上调，对照组足细胞标志物(PODXL、CCBE1)上调;(F-L)免疫荧光：PB 组 12 天 JAG1、HNF1B 表达显著高于对照，HES1(Notch 靶基因)升高，上皮标志物 CDH1 强度增加;(M-N)定量：PB 组 JAG1 + 面积增加 2.36 倍，HNF1B + 面积增加 1.64 倍。图示证实 PI3K 抑制可重定向分化方向，促进近端前体形成。

图 3：PB 类器官的近端小管分化与成熟

该图展示 PB 类器官的分化进程：(A-B)14 天单细胞分析：对照组偏向足细胞(MAFB+、NPHS2+)，PB 组偏向近端前体(HNF4A+、DPP4+);(C-E)标志物分布：PB 组 HNF4A + 细胞从 14 天的小簇发展为 18 天的长管状，且 HNF4G(HNF4A 同源物)共表达，模拟体内近端伸长;(F-I)FACS 验证：HNF4A-YFP + 细胞在 PB 组占 9.90%(对照组 3.61%);(J-N)定量：PB 组 HNF4A + 片段数量增加 4.02 倍，单个片段面积增加 1.30 倍，总近端面积增加 2.83 倍。图示证明 PB 类器官近端小管数量与尺寸显著提升。

图 4：PB 类器官的 nephron 分段与转录特征

该图分析 PB 类器官的细胞组成：(A-B)单细胞时序 UMAP：10-18 天 PB 组逐步分化为近端前体(HNF4A+)，对照组偏向足细胞;(C)细胞来源比例：70.8% HNF4A + 细胞来自 PB 组;(D-G)形态对比：对照组以 WT1 + 足细胞为主，PB 组 HNF4A + 近端小管伸长;(H)时间序列：PB 组 HNF4A-YFP + 细胞从 15 天的边缘分布扩展至 18 天的全器官分布;(I-L)分段标志物：PB 组 21 天 LRP2 + 近端小管显著多于对照，TFAP2A + 远端无差异，HNF1B+/HNF4A + 小管长度分别增加 2.44 倍、1.95 倍。图示明确 PB 类器官的近端偏向特征与分段优势。

图 5：PB 类器官与 PT-E 类器官的转录对比

该图对比两种近端富集模型：(A-C)PB 类器官(21/27 天)：主要含 nephron 谱系(近端 HNF4A+、足细胞 NPHS1+、髓袢 SLC12A1+)，间质细胞少;(D-E)PB 类器官高表达有机离子转运体(SLC22A2/OCT2、SLC22A6/OAT1)，与体内近端分布一致;(F-H)PT-E 类器官：含大量 TFAP2A + 远端、GATA3 + 间质细胞;(I-K)整合分析：PB 组近端标志物(HNF4A、LRP2)表达更高，远端 / 异位标志物(AQP2、MYOG)更低。图示证实 PB 类器官的近端纯度优于 PT-E 模型。

图 6：PB 类器官的功能与损伤响应

该图验证 PB 类器官的生理功能与损伤模拟：(A-B)摄取实验：PB 组 HNF4A-YFP + 小管中荧光白蛋白 / 葡聚糖摄取显著高于对照;(C-F)顺铂损伤：PB 组 HNF4A + 细胞中 HAVCR1 表达升高，蛋白信号增加 1.56 倍;(G-H)结构变化：损伤后 PB 组管状 lumen 断裂(连续 lumen 长度减少 2.82 倍)，ATP1A1( apical 标志物)、LAMB1(基底标志物)极化消失;(I-K)损伤标志物：HNF4A 与 γH2AX 呈负相关(r=-0.67)，SOX9 在 HNF4A + 细胞中上调;(L-N)动态变化：损伤后 1-6 天，细胞从 HNF4A 高 / SOX9 低转变为 HNF4A 低 / SOX9 高，模拟体内 maladaptive 修复。图示证明 PB 类器官具备近端功能且能重现损伤响应。

全文总结

本研究通过短暂 PI3K 抑制(LY294002，10-12 天)激活 Notch 信号，建立了近端偏向的肾类器官模型，核心贡献在于：1. 解决常规类器官近端发育异常问题，HNF4A + 细胞比例提升 2.69 倍，且高表达功能性溶质转运体;2. PB 类器官具备近端小管特异性功能(白蛋白 / 葡聚糖摄取)，能模拟顺铂诱导的损伤与修复过程;3. 与 PT-E 模型相比，PB 类器官近端纯度更高，无远端 / 异位细胞干扰。局限性包括：PB 类器官虽达毛细血管袢期近端成熟度，但未完全达到成人近端小管的转运效率;长期培养(>27 天)仍需优化以维持功能。未来需结合血管化、流体剪切力等微环境调控，进一步提升成熟度，为近端小管疾病建模(如范可尼综合征)与药物筛选提供更精准的平台。