神经生物学中的原代细胞培养：小鼠胚胎后脑神经元培养的优化方案

研究背景

比利时鲁汶大学 Louvain 生物分子科学与技术研究所的 团队发表于《Cells》上题为Primary Cell Cultures in Neurobiology: Optimized Protocol for Culture of Mouse Fetal Hindbrain Neurons的研究，聚焦后脑神经元原代培养缺口。后脑调控呼吸、心率等核心功能，但原代培养受限：后脑分离难、小鼠(常用转基因模型)可靠培养方案缺失、传统培养中胶质细胞易过度增殖;且大鼠后脑培养方案因种属细胞特性差异无法复用，阻碍小鼠后脑功能研究，故本研究建立小鼠胚胎后脑神经元标准化培养方案。

本研究优化小鼠胚胎后脑神经元原代培养流程。方法：取 E17.5 小鼠胚胎后脑，胰酶 - 胶原酶分步消化，NB27 培养基接种，DIV3 加 CultureOne™抑制胶质增殖，培养至 DIV10，通过免疫荧光、膜片钳、RT-qPCR 及 Cre 重组实验验证。结果：DIV10 神经元成熟，高表达谷氨酸能 / GABA 能标志物，形成成熟突触且能产生动作电位，CultureOne™抑制星形胶质细胞过度扩展，转基因神经元 4-OHT 诱导 Cre 重组效率高。结论：该方案获成熟功能正常的小鼠后脑神经元，适用于多类研究，填补小鼠后脑原代培养空白。

实验方法

动物、后脑分离与消化：实验经鲁汶大学伦理委员会批准(#122803)，使用 E17.5 C57Bl6/J 小鼠胚胎，孕鼠颈椎脱臼处死后取胚胎，解剖镜下分离后脑(去除皮质、小脑及颈段脊髓)，机械剪碎后用含胶原酶 II 的溶液(Mix I：800 U/mL，Mix II：300 U/mL+Dispase 3.3 U/mL)分步消化(37℃，1h+30min)，29G 针头吹打后经滤网过滤，300×g 离心 10 分钟，NB27 培养基(Neurobasal™Plus+B-27™Plus + 谷氨酰胺)重悬，手动计数调整密度至 1.34×10⁵±0.38×10⁵ cells/mL。

细胞培养、鉴定与功能检测：多聚赖氨酸(10 μg/mL)包被培养皿，按 1×10⁵ cells / 孔接种，5% CO₂、37℃培养，DIV3 换液时加 1×CultureOne™;DIV10 时 4% 多聚甲醛固定，免疫荧光检测神经元(MAP2/NEUN)、神经递质亚型(VGLUT2/GAD67)及胶质细胞(GFAP/OLIG2/IBA1);RT-qPCR 检测后脑特异性基因(Hoxa5/Gata3)与神经标志物(Vglut2/Gad67);膜片钳(EPC-9 放大器)记录电流钳模式下动作电位;转基因小鼠(Ai14-Rosa26-tdTomato×CMV-CreERᵀ²)后脑神经元经 1 μM 4-OHT 处理，观察 Cre 重组效率。

关键结果

图1：后脑神经元培养流程与细胞形态动态

该图含两部分：A 图(流程图)展示从 E17.5 胚胎后脑分离、消化(胰酶 + 机械吹打)、离心、接种到培养的完整步骤;B 图(形态观察)显示不同 DIV 的细胞状态：DIV3 时后脑神经元开始贴壁并长出短突起，DIV7 时形成局部神经簇，DIV10 时突起交织成网络;皮质神经元作为对照，虽增殖更快，但后脑神经元在 DIV10 时形态成熟(MAP2 免疫荧光阳性)。结果证实培养流程可支持后脑神经元逐步成熟。

图2：后脑神经元亚型鉴定

该图验证神经元类型与后脑特性：A 图(免疫荧光)显示 DIV10 时神经元高表达 MAP2(树突标记，绿色)和 NEUN(神经元核标记，品红)，且 VGLUT2(谷氨酸能，品红)、GAD67(GABA 能，品红)呈点状分布，证实以兴奋性和抑制性神经元为主;B 图(RT-qPCR)显示后脑培养中 Glyt2(甘氨酸转运体，后脑特征)表达较皮质高 15 倍，Hoxa5(后脑特异性转录因子)仅在后脑检测到，Fezf2(端脑标记)在后脑低表达。结果表明培养的神经元保留后脑细胞亚型特征。

图3：神经元突触形成与兴奋性验证

该图证实神经元功能正常：A 图(突触染色)显示 BASSOON(突触前标记，绿色)与 HOMER1(兴奋性突触后，品红)、GEPHYRIN(抑制性突触后，品红)共定位(白色箭头)，证实成熟突触形成;B 图(膜片钳轨迹)显示后脑神经元在 10 pA 去极化电流刺激下，30 pA 时诱发动作电位(幅度 20 mV，静息电位 - 49 mV)。结果证明神经元可形成功能突触并产生兴奋性电活动。

图4：后脑培养中的胶质细胞鉴定

该图展示胶质细胞组成：免疫荧光显示 DIV10 时培养体系含三种胶质细胞：OLIG2 + 少突胶质细胞(品红，髓鞘形成相关)、GFAP + 星形胶质细胞(品红，占比最高，以原浆型为主)、IBA1 + 小胶质细胞(品红，数量最少)，均与 MAP2 + 神经元(绿色)相邻分布。结果表明培养体系保留后脑特异性胶质细胞，且神经元与胶质细胞形成生理相关的细胞微环境。

图5：CultureOne™对细胞群体的影响

该图分析 CultureOne™的作用：A-B 图(免疫荧光)显示加 CultureOne™后，GFAP + 星形胶质细胞(品红)突起扩展减少，斑块形成减少，MAP2 + 神经元(绿色)连接不受影响;C 图(RT-qPCR)显示加 CultureOne™组 GFAP 表达显著降低(p<0.001)，Neun(神经元)、IBA1(小胶质)、Olig2(少突胶质)表达无显著差异;D 图(神经元比例)显示部分培养中神经元比例略有波动，但整体无显著影响。结果证实 CultureOne™可特异性抑制星形胶质细胞过度增殖，维持神经元功能。

图6：转基因后脑神经元的 Cre 重组效率

该图验证转基因适用性：A 图(交配方案)为 Ai14-Rosa26-tdTomato(报告鼠)与 CMV-CreERᵀ²(诱导鼠)交配，后代后脑神经元含 tdTomato 和 CreERᵀ²;B 图(荧光成像)显示 DIV1-2 加 1 μM 4-OHT 后，DIV10 时大量细胞表达 tdTomato(红色)，乙醇对照组仅少量泄漏表达。结果证明该培养体系可高效诱导转基因后脑神经元的 Cre 重组，适用于基因编辑研究。

全文总结

本研究建立了小鼠胚胎后脑神经元的标准化原代培养方案：通过优化分离消化步骤获得高纯度后脑细胞，用 CultureOne™平衡胶质细胞与神经元比例，培养至 DIV10 可获得成熟、功能正常的神经元(形成突触、产生动作电位)，且保留后脑特异性细胞亚型(如高表达 Glyt2/Hoxa5);该方案还可兼容转基因模型，4-OHT 诱导 Cre 重组效率高。该方案解决了小鼠后脑神经元培养中 “分离难、胶质过度增殖、功能维持差” 的核心问题，为后脑生理功能(如呼吸调控)、疾病机制(如脑干病变)及转基因研究提供可靠体外模型，填补了小鼠后脑原代细胞培养的技术空白。