沙眼衣原体（Chlamydia trachomatis）与人原代宫颈内膜基质细胞互作的双 RNA 测序分析

研究背景

沙眼衣原体(Ct)是全球高发的性传播胞内细菌，可致女性盆腔炎、不孕等严重并发症，其致病依赖 “原体(EB)- 网状体(RB)” 双相发育周期。此前研究多采用 HeLa 等永生化细胞分析 Ct - 宿主互作，但这类细胞遗传变异大，无法模拟体内真实免疫反应;且缺乏对 “临床常见 Ct 菌株 + 人原代生殖系统细胞” 的转录组同步解析。宫颈内膜基质细胞(ECS)是 Ct 感染的关键靶细胞，双 RNA-seq 技术可同时捕获宿主与病原体转录组，为此团队以 Ct E/Bour 株(泌尿生殖系统优势株)感染人原代 ECS 细胞，解析感染早期(1hpi)与中期(24hpi)的互作机制，填补原代细胞模型研究空白。

本研究通过双 RNA-seq 解析 Ct E/Bour 株感染人原代 ECS 细胞的转录组动态：从子宫切除术组织分离 ECS 细胞(fibronectin 染色验证)，以 MOI=1 感染后，在 1hpi 和 24hpi 提取 RNA 并测序，用 DESeq2 分析差异表达基因(DEGs)、gProfiler 富集通路。结果显示，宿主方面：1hpi 仅 168 个 DEGs(40% 为非编码 RNA / 新蛋白)，无显著通路富集，提示早期免疫抑制;24hpi 有 212 个 DEGs，IFN 刺激基因(ISGs)上调、cGAS-STING/RLR 通路激活，但无 I 型 IFN 表达，促炎与白细胞募集基因高表达。Ct 方面：1hpi 338 个基因中包涵体膜基因(如 cpoS)高表达;24hpi 914 个基因中溶血素样基因(CT256/257/423)、多形膜蛋白(PmpB-I)上调。结论：Ct 感染呈 “早期抑制宿主免疫 - 中期激活先天免疫” 动态，原代 ECS 模型更贴近生理状态，为 Ct 致病机制研究提供新依据。

实验方法

从匿名无癌子宫切除术组织获取 ECS 细胞(fibronectin 染色验证)，用 Ct E/Bour 株以 MOI=1 感染 80% 汇合度的 ECS 细胞，37℃离心 1 小时促进感染;分别在 1hpi 和 24hpi 用 TRI 试剂收集细胞总 RNA(RIN>7.0)，经 Illumina Ribo-Zero 试剂盒去除人 / 细菌 rRNA 后，感染组 RNA 分两部分(直接建库 / 富集原核 mRNA)，用 KAPA HyperPrep 试剂盒构建文库，Illumina NovaSeq 6000 进行 150bp 双端测序;宿主转录组用 Nextflow rnaseq 包定量，Ct 转录组经 Fastp 质控 + Scrubby 去宿主污染后定量，DESeq2 筛选 DEGs(FDR≤0.05，log₂FC≥2)，gProfiler/STRING 进行通路富集。

关键结果

图1：1hpi 时 ECS 细胞的差异表达基因(DEGs)

该图展示 Ct 感染 1hpi 时 ECS 细胞与未感染组的 DEGs：A 图火山图显示 168 个 DEGs(FDR≤0.05，log₂FC≥2)，其中 107 个上调、61 个下调;B 图前 20 个 DEGs 中，上调最显著的是 SNORD3D(小核仁 RNA)，下调显著的包括新蛋白基因和长链非编码 RNA，且 40% DEGs 为非编码 RNA、新蛋白或假基因，印证早期宿主反应微弱且多涉及未明确功能的转录本。

图2：24hpi 时 ECS 细胞的差异表达基因(DEGs)

该图呈现 Ct 感染 24hpi 时 ECS 细胞的 DEGs：A 图火山图显示 212 个 DEGs(FDR≤0.05，log₂FC≥2)，164 个上调、48 个下调;B 图前 20 个 DEGs 中，6 个为 IFN 刺激基因(如 OAS1、IFITM1)，另有 CCL2、CXCL10 等促炎与白细胞募集基因，表明中期宿主先天免疫与炎症反应显著激活，与 1hpi 的微弱反应形成鲜明对比。

图3：24hpi 时 ECS 细胞的富集生物学过程

该图通过 SRplot 可视化 24hpi 时宿主 DEGs 的富集通路：前 10 个富集生物学过程中，“病毒应答” 通路最显著(含 28 个 DEGs)，其次是 “细菌脂多糖应答”“I 型 IFN 信号”，且关键 DEGs(如 OAS1、CXCL10)均上调，证实中期宿主以先天免疫激活为核心反应，虽无 I 型 IFN 表达，但 ISGs 的高表达仍驱动免疫应答。

图4：ECS 细胞中 cGAS-STING 与 RLR-MAV 通路的激活情况

该图为 24hpi 时宿主先天免疫通路的基因表达热图：红色框代表 log₂FC≥2 的显著上调基因(如 DDX58、OAS1-3)，橙色框代表 log₂FC<2 但 FDR≤0.05 的中度上调基因，白色框为未表达基因;结果显示 cGAS-STING 与 RLR-MAV 通路的 7 个关键基因均显著上调，且无 I 型 IFN 表达，提示 Ct 可能通过抑制 I 型 IFN 生成，选择性激活 ISGs 以维持宿主细胞存活。

图5：Ct 的差异表达基因与测序数据

该图展示 Ct 在不同感染阶段的转录组特征：A-B 图显示 1hpi 和 24hpi 时，rRNA+polyA 双去除法获取的 Ct 读数显著多于仅 rRNA 去除法;C 图欧氏距离聚类显示 1hpi 与 24hpi 的 Ct 读数聚类完全分离;D 图火山图显示 462 个 Ct DEGs(71 个 1hpi 高表达，393 个 24hpi 高表达);E 图前 10 个 DEGs 中，1hpi 以包涵体膜基因(如 CT867、cpoS)为主，24hpi 以 DNA 外切酶基因(recJ)、Pmp 基因(pmpC)为主，证实 Ct 基因表达的阶段特异性。

图6：Ct 差异表达基因的富集通路

该图分析 Ct DEGs 的富集通路：A 图 1hpi 时 “分泌与跨膜蛋白” 通路最显著，含 7 个包涵体膜基因(如 incB/C/D、cpoS);B 图 24hpi 时 “催化活性”“其他生物过程调控” 通路最显著，后者含 8 个 Pmp 基因(PmpB-I)和 3 个溶血素样基因;C-D 图网络交互图显示 1hpi 核心通路为跨膜蛋白相关，24hpi 为代谢与宿主调控相关，揭示 Ct 早期依赖包涵体膜基因建立感染，中期依赖 Pmp 与溶血素样蛋白维持增殖。

全文总结

本研究首次用双 RNA-seq 解析 Ct E/Bour 株感染人原代 ECS 细胞的转录组动态，发现 Ct 感染呈现 “早期抑制宿主免疫(1hpi DEGs 少且多为非编码 RNA，无显著通路富集)- 中期激活先天免疫(24hpi ISGs 上调、cGAS-STING/RLR 通路激活)” 的时间规律，Ct 则通过早期高表达包涵体膜基因建立感染、中期高表达 Pmp 与溶血素样基因维持增殖;原代 ECS 细胞模型避免了永生化细胞的生理偏差，为 Ct 致病机制研究提供更贴近体内的依据，同时也指出研究局限(单供体来源细胞、缺乏蛋白水平验证)，未来需扩大供体样本并结合功能实验深化机制解析。