巨噬细胞通过 CXCL5/8-CXCR2 轴促进多发性骨髓瘤（MM）异常 DNA 修复的机制研究

研究背景

多发性骨髓瘤(MM)是一种难治性血液肿瘤，基因组不稳定与异常 DNA 修复是其复发的关键，但骨髓微环境中巨噬细胞(MΦs)对 MM 细胞 DNA 修复的调控机制尚不明确。已知 MΦs 在 MM 微环境中极化为 M2 型，可促进 MM 细胞存活与耐药，且复发难治 MM(RRMM)患者骨髓中 MΦs 比例高于初诊患者;CXCL5/8-CXCR2 趋化因子轴在肿瘤中调控血管生成，却未被证实与 MM 细胞 DNA 修复相关。因此，本研究旨在解析 MΦs 是否通过 CXCL5/8-CXCR2 轴调控 MM 细胞 DNA 修复，填补该领域机制空白。

本研究通过体外共培养、NOD-SCID 小鼠异种移植、CRISPR/Cas9 介导 DNA 双链断裂(DSB)及临床标本分析，探究 MΦs 对 MM 细胞 DNA 修复的影响。结果显示：MΦs 可加速 MM 细胞 DSB 修复(降低 γH2AX 水平、缩短彗星尾)，该效应由 CXCL5/8-CXCR2 轴介导(抑制 CXCR2 或中和 CXCL5/8 可阻断该效应);MΦs 显著提升 MM 细胞非同源末端连接(NHEJ)效率，但降低修复准确性(更长缺失片段、>3bp 缺失比例升高)，并增加 IgH-CCND1 染色体易位频率;临床标本中，MM 患者骨髓 MΦs 含量与 FISH 阳性率(尤其 IgH 易位)及复杂核型比例正相关(高 MΦs 组复杂核型阳性率 62.5%，低 MΦs 组 0%)。结论：MΦs 通过 CXCL5/8-CXCR2 轴促进 MM 细胞致突变 NHEJ 与染色体易位，增加基因组不稳定性，为 MM 靶向治疗提供新靶点。

实验方法

实验经浙江大学医学院附属第一医院伦理批准，采用 MM 细胞系(ARP-1/MM.1S 等)、健康供体 / MM 患者来源 MΦs(M-CSF 诱导分化);体外共培养后用 X 射线 / 博来霉素诱导 DSB，通过 Western blot、免疫荧光、彗星实验检测 DNA 损伤;RT-qPCR/ELISA 检测 CXCL5/8-CXCR2 表达，用拮抗剂、中和抗体或 siRNA 验证其作用;CRISPR/Cas9 诱导特异性 DSB，NGS 分析 NHEJ 修复及 IgH-CCND1 易位;构建 NOD-SCID 小鼠 MM 异种移植模型，瘤内注射 MΦs 后检测体内 DNA 修复;收集 33 例 MM 患者骨髓标本，FISH 检测核型异常并关联 MΦs 含量。

关键结果

图1：MΦs 体外促进 MM 细胞 DSB 修复

该图通过 Western blot、免疫荧光及彗星实验，显示 X 射线或博来霉素诱导 DSB 后，与 MΦs 共培养的 ARP-1/MM.1S/CAG 细胞 γH2AX 水平下降更快(8h 时显著低于单独培养组)，γH2AX 阳性细胞比例更少，彗星尾更短，证实 MΦs 在体外可加速 MM 细胞 DSB 修复。

图2：MΦs 体内促进 MM 细胞 DSB 修复

该图为 NOD-SCID 小鼠 MM 异种移植实验，显示辐射诱导 DSB 后，瘤内注射 MΦs 的小鼠肿瘤中 γH2AX 水平更低，γH2AX 阳性细胞更少，且与 CD68 标记的 MΦs 相邻的 MM 细胞 γH2AX 焦点更少，彗星尾更短，验证 MΦs 在体内同样促进 MM 细胞 DSB 修复。

图3：CXCL5/8-CXCR2 轴介导 MΦs 对 MM 细胞 DNA 修复的促进作用

该图通过 RT-qPCR、ELISA 及功能实验，显示 MΦs 与 MM 细胞共培养后 CXCL5/8 分泌增加，MM 细胞 DNA 损伤后 CXCR2 表达上调;添加 CXCR2 拮抗剂、CXCL5/8 中和抗体或沉默 MΦs 中 CXCL5/8，均显著减弱 MΦs 对 MM 细胞 γH2AX 降解的促进作用，证实 CXCL5/8-CXCR2 轴是关键介导通路。

图4：干扰 CXCL5/8-CXCR2 轴抑制 MΦs 体内保护 MM 细胞的作用

该图为小鼠体内干预实验，显示辐射后注射 MΦs 的小鼠肿瘤体积更大，而联合 CXCR2 拮抗剂或 CXCL5/8 中和抗体后，肿瘤体积显著缩小，且肿瘤中 γH2AX 水平回升，证明体内干扰该轴可阻断 MΦs 对 MM 细胞的保护作用。

图5：MΦs 体外促进 MM 细胞致突变 NHEJ 修复

该图用 CRISPR/Cas9 诱导 AAVS1/HBB 位点 DSB，NGS 分析显示，与 MΦs 共培养的 MM 细胞 NHEJ 效率更高，但准确 NHEJ 比例降低，Group I 缺失片段更长(AAVS1 位点 median 10bp vs 对照 9bp)，>3bp 缺失比例更高(51.68% vs 对照 48.55%)，证实 MΦs 促进致突变 NHEJ。

图6：MΦs 体内促进 MM 细胞致突变 NHEJ 修复

该图为小鼠体内 NHEJ 检测，显示肿瘤中注射 MΦs 后，MM 细胞 NHEJ 效率显著升高，准确 NHEJ 比例降低，缺失片段更长(median 25bp vs 对照 17bp)，>3bp 缺失比例更高(70.04% vs 对照 57.80%)，与体外结果一致，证实 MΦs 体内同样促进致突变 NHEJ。

图7：MΦs 促进 MM 细胞 IgH-CCND1 染色体易位

该图用 CRISPR/Cas9 诱导 IgH(14q32)与 CCND1(11q13)位点 DSB，PCR 及 NGS 显示，与 MΦs 共培养的 MM 细胞 IgH-CCND1 der (14) 易位产物更多，易位频率显著升高，证实 MΦs 可增加 MM 细胞染色体易位风险。

图8：MM 患者骨髓 MΦs 含量与核型复杂性正相关

该图分析 33 例 MM 患者骨髓标本，显示 CD68 标记的 MΦs 含量分为 +、++、+++ 三级，级别越高，FISH 阳性率(尤其 IgH 易位、D13S319 缺失)越高，复杂核型(≥3 个 FISH 阳性)阳性率也越高(+++ 组 62.5%，++ 组 22.2%，+ 组 0%)，且高风险 MM 患者来源 MΦs 促进 MM 细胞 DNA 修复的能力更强。

全文总结

本研究明确骨髓微环境中的巨噬细胞(MΦs)通过 CXCL5/8-CXCR2 轴调控多发性骨髓瘤(MM)细胞 DNA 修复：MΦs 不仅在体外和体内加速 MM 细胞 DSB 修复，还通过促进致突变的非同源末端连接(NHEJ)降低修复准确性，增加染色体易位频率，最终导致 MM 细胞基因组不稳定;临床数据进一步证实患者骨髓 MΦs 含量与核型复杂性正相关，高 MΦs 水平提示更差的基因组稳定性。该研究填补了 “微环境 - DNA 修复 - MM 进展” 的机制空白，明确 CXCL5/8-CXCR2 轴为 MM 靶向治疗的潜在靶点，为改善复发难治 MM 患者预后提供新方向。