乳腺类器官的光片显微镜活细胞成像与完整实验方案

乳腺类器官(MGOs)可模拟乳腺细胞异质性与生长因子响应，是乳腺发育及疾病研究的核心工具，但传统成像技术存在局限：明场显微镜分辨率低，共聚焦显微镜光毒性强，终点检测无法捕捉动态过程。光片荧光显微镜(LSFM)通过垂直照明 - 检测设计，低光毒且成像快，适配活类器官 4D 成像。本研究旨在建立 MGOs 分离、冻存、培养及两种 LSFM(多视角、倒置)成像的完整方案，解决长期活细胞成像痛点。

来自捷克马萨里克大学、欧洲分子生物学实验室(EMBL)的团队在《Journal of Mammary Gland Biology and Neoplasia》(2025 年，Vol. 30)发表题为Live-cell imaging of mammary organoids using light sheet microscopy的研究。

核心内容如下：

(1)研究方法

乳腺类器官制备与培养： euthanasia 后分离小鼠 3-4 号乳腺，去除淋巴结，用含胶原酶和胰蛋白酶的消化液 37℃振荡消化 30 分钟，450×g 离心后经 BSA 涂层管减少黏附，DNase I 处理去杂质，差异离心分离类器官;无血清冻存液(Synth-A-Freeze/Cellbanker 2)冻存(1mL 含 1000-3000 个类器官)，复苏时 37℃水浴后用 DMEM/F12 稀释离心;接种时类器官与 ECM 混合铺板，单细胞类器官需额外经长时消化、胰酶解离为单细胞，胶原 I 涂层培养后再接种。

LSFM 成像与样本制备：多视角 LSFM 将类器官注入 FEP 管(1-3mm)，ECM 包裹后置于 37℃、5% CO₂成像室，ZEISS Lightsheet 7 成像(10 分钟间隔，持续 24 小时);倒置 LSFM 将类器官接种于 V 形 FEP 孔，大尺寸类器官直接铺 ECM，小尺寸类器官需消化重悬后用混合 ECM 接种，Luxendo TruLive3D 成像;明亮场定位样本，设激光功率与 Z 轴范围，按实验需求调整时间间隔(3-30 分钟)，图像经最大强度投影(MIP)处理。

(2)关键结果

成功建立 MGOs 全流程实验体系，组织消化得率达每只小鼠 1000-3000 个，无血清冻存液复苏存活率高于含 FBS 冻存液，复苏后 6 天内可复现分支形态;验证两种 LSFM 适配性，多视角 LSFM 适合大尺寸上皮碎片类器官(>100μm)，可同时成像多个样本，倒置 LSFM 适合小尺寸单细胞类器官(<50μm)，成像质量稳定;实现长期动态成像，捕捉单细胞类器官 72 小时生长、上皮碎片类器官 18 小时分支延伸及 4 小时信号波动，全程无光毒性导致的形态异常。

实验结果

图 1：光片荧光显微镜(LSFM)原理与两种成像 setup

该图对比多视角与倒置 LSFM 的工作原理及代表性图像。(A)多视角 setup：样本悬浮于成像室中央，照明与检测物镜在同一平面环绕样本，示意图展示 FEP 管样本 holder;(B)多视角 LSFM 的乳腺 EKAREV-NLS 类器官明场与荧光图像，荧光信号清晰标记核内 biosensor;(C)倒置 setup：检测物镜位于 V 形样本 holder 下方，成像室充水，示意图展示 V 形 FEP 孔结构;(D)倒置 LSFM 的类器官图像，明场可见 ECM 包埋的类器官，荧光图显示核标记信号。图示明确两种 setup 的核心差异，为后续样本 mounting 提供原理支撑。

图 2：不同冻存液对乳腺类器官复苏后形态的影响

该图比较 4 种冻存液(CellBanker 2、Synth-A-Freeze、FBS+10% DMSO、DMEM+10% DMSO+10% FBS)复苏后类器官的形态发生。类器官冻存 5 周后复苏，在 2.5nM FGF2 培养 6 天，无血清冻存液(CellBanker 2、Synth-A-Freeze)组类器官分支更完整、 lumen 清晰，而含 FBS 的冻存液组类器官形态不规则、分支减少。图示证实无血清冻存液更适合乳腺类器官长期保存，为样本储备提供优化方案。

图 3：多视角 LSFM 的样本 mounting 步骤

该图详细展示多视角 LSFM 的 FEP 管样本制备流程。(A)所需器材：100mm 培养皿、24-26G 针头、1mL 注射器、 parafilm;(B)组装的 holder 示意图，箭头标注 FEP 管片段;(C-J) mounting 关键步骤：空 FEP 管(C)→注入 ECM 形成双凸结构(D)→加入类器官(白色箭头，E)→ECM 覆盖密封(F-G)→注射器安装到多视角平台(H)→样本置于成像室(I-J)。图示分步指导复杂的 FEP 管 mounting 操作，降低实验重复性难度。

图 4：倒置 LSFM 的样本 mounting 步骤

该图展示倒置 LSFM 的 V 形 FEP 孔样本制备。(A)标记的 V 形样本 holder 置于操作架;(B)V 形 holder 放入成像室;(C-E)关键步骤：在 V 形孔底部滴加 Matrigel(C)→用移液器 tip 将 ECM 铺展成线(D)→转移类器官至 ECM 线中央(E)。图示简化倒置 setup 的样本制备，突出 V 形孔对小尺寸类器官定位的优势。

图 5：乳腺类器官的 LSFM 时间序列成像结果

该图呈现 3 种时间序列成像案例。(A)单细胞来源类器官：H2B-mCherry 标记核，SPY650-FastAct 标记 actin，72 小时内(30 分钟间隔)从 8-10 细胞生长为带 lumen 的小囊泡，比例尺 20μm;(B)上皮碎片来源类器官：EKAREV-NLS biosensor 标记，18 小时(10 分钟间隔)内分支逐步延伸，荧光信号反映 ERK 活性，比例尺 40μm;(C)上皮碎片类器官 4 小时高频率成像(3 分钟间隔)，捕捉 biosensor 信号的瞬时变化，比例尺 100μm。图示直观验证 LSFM 对不同类型乳腺类器官的长期动态追踪能力，体现技术在形态与信号监测中的双重价值。

全文总结

本研究建立 MGOs 分离、冻存、培养及 LSFM 成像的完整方案，核心贡献包括：优化制备流程，无血清冻存液提升复苏后存活率;阐明两种 LSFM 适配性，多视角适合大尺寸、倒置适合小尺寸类器官;实现长期动态成像，捕捉类器官生长与信号变化且无光毒。方案填补 MGOs 长期活成像空白，为乳腺研究提供工具。局限性为大尺寸类器官倒置成像受限，未涉及人类 MGOs，后续需优化适配性。