延长 FGF9 处理减少 iPSC 来源肾类器官异位软骨细胞并维持肾结构与功能的研究

iPSC 来源的肾类器官是研究肾病、药物毒性的重要模型，但长期培养(7+18 至 7+25 天)会出现异位软骨细胞(占 10-20%)，伴随 COL2A1、SOX9 等软骨标志物升高，破坏类器官结构与质量，现有培养方案(如 Takasato 协议)未解决该问题。FGF9 是肾发育关键因子，且能抑制间充质干细胞向软骨分化，因此研究通过延长 FGF9 处理时间优化培养方案，旨在减少异位软骨，同时保留肾结构功能。

来自荷兰马斯特里赫特大学 MERLN 再生医学研究所的团队在《npj Regenerative Medicine》(2025 年，Vol. 10)发表题为FGF9 treatment reduces off-target chondrocytes from iPSC-derived kidney organoids的研究。

核心内容如下：

(1)研究方法

iPSC 培养与肾类器官生成：采用 3 株人 iPSC(LUMC0072iCTRL01 等)，按 Takasato 协议诱导分化：2D 阶段用 CHIR99021(8μM)处理 4 天，再用 FGF9(200ng/mL)+ 肝素处理 3 天;7+0 天细胞聚集后置于气液界面，对照组培养至 7+5 天撤去生长因子，FGF9 处理组延长 FGF9(无肝素)处理至 7+12 天，两组均培养至 7+25 或 7+32 天，每组至少 3 个类器官用于染色，3 个用于分子检测。

检测与验证：阿尔新蓝染色(全器官及冷冻切片)鉴定软骨;免疫荧光检测肾结构标志物(肾小球 NPHS1、近端小管 LTL、远端小管 ECAD、髓袢 SLC12A1)、血管标志物 CD31 及 EMT 标志物(波形蛋白、α-SMA);Western blot 和 qPCR 量化软骨标志物(SOX9、COL2A1、ACAN)、肾功能标志物 AQP2;BSA 摄取实验评估肾小管功能;统计采用 t 检验或 ANOVA，p<0.05 为显著差异。

(2)关键结果

肾类器官在 7+18 至 7+25 天出现明显异位软骨(阿尔新蓝阳性，COL2A1 蛋白升高 3.5 倍，SOX9 mRNA 升高);延长 FGF9 处理至 7+12 天，7+25 天软骨显著减少(阿尔新蓝染色阴性)，软骨标志物(SOX9 蛋白降 3 倍、COL2A1 蛋白降 4 倍)及 EMT 标志物(波形蛋白、α-SMA)显著降低;FGF9 处理不影响肾结构，肾小球、肾小管标志物表达正常，且出现血管样结构(CD31 升高)，AQP2 表达增强(水重吸收功能提升)，BSA 摄取量增加(近端小管功能增强);7+32 天 FGF9 组仅类器官边缘出现少量软骨，显著少于对照组 7+25 天的软骨量。

实验结果

图 1：肾类器官培养流程与异位细胞出现

该图展示培养方案与类器官形态：(A)流程示意图：iPSC 经 2D 分化(CHIR99021、FGF9 处理)后聚集为类器官，对照组 7+5 天撤生长因子，FGF9 组延长处理至 7+12 天;(B-C)明场图：7+18 天类器官形态规则，7+25 天形态不规则;(D-G)免疫荧光：7+18 天可见肾小球(NPHS1)、肾小管(LTL/ECAD)等肾结构，7+25 天出现无肾标志物的异位细胞(星号)。图示明确异位细胞出现的时间节点，为后续干预提供依据。

图 2：异位细胞鉴定为软骨

该图验证软骨形成：(A-D)阿尔新蓝染色：7+18 天无软骨，7+25 天全器官及切片均见软骨(蓝色);(E-I)qPCR：7+25 天 SOX9、COL2A1 等软骨标志物显著升高;(J-L)Western blot：COL2A1 蛋白升高 3.5 倍，SOX9 蛋白无显著变化。图示确认异位细胞为软骨，且标志物随培养时间升高。

图 3：FGF9 处理减少 7+25 天软骨形成

该图展示 FGF9 干预效果：(A)处理流程：FGF9 延长至 7+12 天;(B-E)阿尔新蓝染色：对照组 7+25 天全器官及切片均见软骨，FGF9 组无软骨。图示直观证明 FGF9 可有效抑制软骨形成。

图 4：FGF9 降低软骨标志物表达

该图量化分子变化：(A-E)qPCR：FGF9 组 SOX9、COL2A1 等软骨标志物 mRNA 显著降低;(F-H)Western blot：FGF9 组 SOX9 蛋白降 3 倍、COL2A1 蛋白降 4 倍。图示从分子水平验证 FGF9 对软骨分化的抑制作用。

图 5：FGF9 不影响肾结构且促进血管形成

该图验证肾结构与血管：(A-D)免疫荧光：FGF9 组 7+25 天仍可见肾小球(NPHS1)、肾小管(LTL/ECAD)，无异位细胞(星号);(E-F)甲苯胺蓝染色：FGF9 组出现血管样结构(#)，对照组无;(G-H)CD31 染色：FGF9 组血管标志物表达显著高于对照。图示证明 FGF9 不损伤肾结构，还能促进血管生成。

图 6：FGF9 提升肾类器官功能

该图评估肾功能：(A-D)AQP2 染色：FGF9 组肾小管 AQP2 表达显著高于对照;(E-H)BSA 摄取：FGF9 组近端小管(LTL 阳性)的 BSA 荧光更强。图示表明 FGF9 处理提升肾类器官的水重吸收和物质转运功能，增强生理相关性。

全文总结

本研究通过延长 FGF9 处理时间(至 7+12 天)，成功解决 iPSC 肾类器官长期培养的异位软骨问题，同时保留肾结构完整性，提升血管形成与肾功能(AQP2、BSA 摄取)，减少 EMT，显著提高类器官质量。核心价值在于提供可重复的优化方案，为肾类器官在疾病建模(如多囊肾)、药物毒性测试中的应用奠定基础。局限性为 7+32 天仍有少量软骨复发，未来需结合其他小分子(如 SOX9 抑制剂)进一步延长稳定期;且暂未验证体内移植效果，后续需评估 FGF9 处理类器官的体内功能。