整合内皮网络的脑类器官模拟神经血管单元并减轻核心坏死研究

传统脑类器官(COs)虽能模拟脑发育与疾病，但缺乏血管化导致营养 / 氧气无法渗透至核心，引发缺氧、代谢应激及核心坏死，且无法复现神经血管单元(NVU)这一关键生理结构(由内皮细胞、星形胶质细胞终足、周细胞及基底膜构成，维持血脑屏障 BBB 功能)。现有血管化策略存在内皮网络渗透不足、缺乏管腔灌注、与神经组织发育需求冲突等问题，难以兼顾结构完整性与生理相关性。为此，研究团队开发了一种基于细胞包封的新方法，将人脑微血管内皮细胞(HBMVECs)通过可降解 ECM 水凝胶(Geltrex™)整合到发育中的脑类器官中，构建含功能性内皮网络的血管化脑类器官，模拟 NVU 并缓解核心坏死，提升模型的生理相关性与应用价值。

来自爱尔兰戈尔韦大学、爱丁堡大学的团队在《Advanced Science》(2025 年)发表题为Cerebral Organoids with Integrated Endothelial Networks Emulate the Neurovascular Unit and Mitigate Core Necrosis的研究。

核心内容如下：

(1)研究方法

脑类器官与内皮细胞培养：采用 A-iPSC、S-iPSC 按 Lancaster 协议构建脑类器官，人脑微血管内皮细胞(HBMVECs)在含 1% 明胶的 ECG 培养基中培养;优化 Geltrex™浓度(40%-90%)、培养基比例(ECG: 类器官成熟培养基 1:7)及 VEGF 剂量(50ng/mL)，以促进内皮网络形成。

内皮网络整合策略：培养第 8 天(Day8)将 HBMVECs(5×10⁴/ 个类器官)包封在 Geltrex™液滴中与类器官共培养，设置无 HBMVECs、仅 VEGF 处理、混合培养基处理等对照，动态培养至第 40 天。

功能与结构表征：通过免疫荧光(CD31、GFAP、CLDN5 等标志物)、纳米压痕测组织刚度、ELISA 检测 VEGF/MMP-9 浓度、70kDa 葡聚糖 - 罗丹明 B 渗透实验评估营养运输、TUNEL 检测凋亡、组织透明化结合共聚焦成像观察网络分布。

内源性内皮分化验证：构建皮质类器官(双 SMAD 抑制抑制中胚层分化)，用荧光 iPSC 衍生内皮细胞(Z-ECs)追踪内皮细胞来源，明确网络双源性(外源性 HBMVECs + 内源性分化 ECs)。

(2)关键结果

血管化条件优化：40% Geltrex™浓度下内皮网络连接最密集(血管面积占比最高、管长最长)，50ng/mL VEGF 显著提升网络连通性;1:7 ECG - 类器官混合培养基平衡神经发育与血管生成，80% Geltrex™兼顾结构支撑与内皮渗透，为最佳培养条件。

内皮网络特征：形成的内皮网络呈双来源 —— 外源性 HBMVECs 与类器官内源性分化 ECs(A-iPSC 类器官内源性 ECs 更多，双 SMAD 抑制可阻断该分化);网络具备 BBB 核心特征：内皮细胞表达 VE-CAD/CLDN5(紧密连接)，星形胶质细胞终足(GFAP⁺)包裹血管，NG2⁺周细胞附着，基底膜含 IV 型胶原 / 层粘连蛋白 α5。

生理功能改善：血管化类器官 70kDa 葡聚糖渗透效率提升，营养运输能力增强;凋亡面积减少 3 倍，核心坏死区域缩小，神经玫瑰花结(SOX2⁺)从边缘向中心分布;组织刚度(0.5-3kPa)与体内脑组织(0.1-1kPa)接近，未因内皮网络整合发生显著变化。

分子机制：VEGF 通过正反馈促进 ECs 分泌更多 VEGF(培养上清 VEGF 达 100ng/mL 以上)，同时诱导 ECs 分泌 MMP-9(达 10ng/mL)加速 Geltrex™降解，促进内皮网络向类器官内渗透。

实验结果

图 1：脑类器官血管化策略示意图

该图对比传统与血管化脑类器官的构建流程。(A)传统流程：iPSC→胚胎体(D0-D5)→神经上皮诱导(D5-D8)→类器官成熟(D11-D40)，无内皮细胞整合;(B)血管化流程：Day8 将 HBMVECs 包封在 Geltrex™液滴中与类器官共培养，添加 VEGF + 混合培养基，最终形成含内皮网络的类器官。图示明确关键干预节点(Day8 包封)与核心试剂，为实验设计提供直观框架。

图 2：HBMVECs 网络形成的条件优化

该图筛选促进内皮网络的关键参数。(A)实验设计：HBMVECs 包封在不同浓度 Geltrex™中，测试培养基与 VEGF 的影响;(B-C)Geltrex™浓度：40% 时网络密度最高，80% 时网络稀疏;VEGF 显著提升血管面积与管长，降低网络间隙度;(D-E)混合培养基：1:7 ECG - 类器官培养基形成的网络管长最长、节点最多;(F-G)VEGF 剂量：50ng/mL 每 4 天添加最优。图示明确各参数对网络形态的影响，确定后续实验的优化条件。

图 3：血管化对脑类器官生长与分子分泌的影响

该图分析血管化对类器官表型的作用。(A-B)生长曲线：血管化类器官(BECs MM+VEGF)早期生长更快，Day40 大小与对照无差异，但圆形度更高(形态更均一);(E)刚度检测：血管化与对照类器官刚度无显著差异，均接近体内脑组织;(F-H)Geltrex™降解：血管化组降解更快，VEGF/MMP-9 分泌显著高于对照，证明 ECs 通过 MMP-9 加速基质降解。图示表明血管化不影响组织刚度，但改善形态均一性与基质渗透。

图 4：类器官表面内皮网络的形态差异

该图对比不同条件下的表面内皮网络。(A)iPSC 系差异：A-iPSC 类器官在无 HBMVECs 时也能自发形成 CD31⁺网络，S-iPSC 类器官需 HBMVECs+VEGF 才形成网络;(B-C)CD31⁺面积：A-iPSC 类器官在 BECs MM+VEGF 条件下网络占比达 15%，显著高于 S-iPSC;(E-H)Geltrex™浓度：60% 时网络分支更多，95% 时血管直径更宽但连续性差，80% 为最佳平衡。图示揭示 iPSC 系间的内皮分化差异，及 Geltrex™浓度对网络形态的调控。

图 5：内皮细胞的来源验证

该图明确内皮网络的双源性。(A-B)早期类器官：Day5-Day8 无中胚层标志物 brachyury，仅表达外胚层标志物 OTX2，证明神经诱导成功;(C-D)皮质类器官：双 SMAD 抑制后，内源性 ECs 显著减少，CD31⁺面积与 S-iPSC 类器官接近;(F-H)荧光追踪：Z-ECs(荧光标记)与内源性 CD31⁺细胞共同形成网络，证实双来源。图示证明内源性 ECs 来自类器官的中胚层分化，双 SMAD 抑制可阻断该过程。

图 6：血管化类器官的血脑屏障特征

该图验证内皮网络的 NVU 模拟能力。(A-B)网络渗透：血管化类器官内 CD31⁺网络数量显著高于对照，主要分布在细胞低密度区域;(C-E)细胞互作：ECs 表达 VE-CAD，GFAP⁺星形胶质细胞终足包裹血管，NG2⁺周细胞附着在网络周围;(F-H)基底膜：Masson 染色显示血管周围胶原沉积，免疫荧光证实含 IV 型胶原与层粘连蛋白 α5;(I)紧密连接：ECs 表达 CLDN5。图示证明内皮网络具备 BBB 的结构特征，成功模拟神经血管单元。

图 7：血管化类器官的功能改善

该图评估血管化的生理功能提升。(A-B)葡聚糖渗透：血管化 A - 类器官的 70kDa 葡聚糖⁺面积显著高于对照，S - 类器官无差异;(C-D)网络 lumen：葡聚糖在血管周围形成 “halo”，H&E 染色观察到开放管腔;(E-H)凋亡分析：血管化类器官凋亡细胞占比减少 3 倍，核心区域凋亡分布更均匀，神经玫瑰花结从边缘转向中心。图示表明血管化提升营养运输能力，减轻核心坏死，改善细胞存活。

全文总结

本研究开发了一种简单高效的脑类器官血管化方法，通过 Day8 将 HBMVECs 包封在 Geltrex™中与类器官共培养，在优化条件(80% Geltrex™、50ng/mL VEGF、1:7 混合培养基)下形成双来源内皮网络，成功模拟神经血管单元的结构(BBB 特征、细胞互作)与功能(营养渗透)，显著减轻类器官核心坏死，且不影响神经发育与组织刚度。该模型解决了传统脑类器官生理相关性差的问题，为脑血管疾病建模(如血脑屏障破坏)、药物筛选(如中枢药物渗透评估)提供了更贴近体内的平台;局限性在于尚未实现内皮网络的灌注功能，长期培养(>40 天)的网络稳定性与神经成熟度需进一步验证。未来结合微流控技术实现灌注，或整合更多 NVU 细胞(如微胶质细胞)，可进一步提升模型的临床转化价值。