男性乳房发育症患者来源类器官的构建与表征研究

男性乳房发育症(乳腺良性增生)是男性常见乳腺疾病，发病率达 30%-65%，分为生理性、特发性和激素相关性亚型，不仅引发躯体不适，还导致患者自尊下降、社交焦虑等心理负担。然而，该疾病的机制研究与治疗开发长期受限于缺乏生理相关性体外模型 —— 传统 2D 培养无法复现乳腺组织架构与激素响应，现有类器官研究多聚焦女性乳腺或恶性肿瘤，尚未有针对男性乳房发育症的专属模型。类器官技术凭借自我组织性、细胞异质性保留等优势，为构建疾病特异性模型提供可能，因此本研究旨在建立标准化的男性乳房发育症患者来源类器官培养方案，验证其与原组织的形态和分子保真度，填补男性良性乳腺疾病体外建模的空白。

来自河北医科大学第一医院的团队在《Frontiers in Bioengineering and Biotechnology》(2025 年，Vol. 13)发表题为“A protocol for organoids from the gynecomastia patients”的研究。

实验方法：

样本收集与伦理：纳入 6 例男性乳房发育症患者(1 例生理性、2 例特发性、3 例激素相关性)，术中获取乳腺腺体组织，记录患者年龄、BMI 及血清激素水平(FSH、LH、催乳素、睾酮等);经医院伦理委员会批准(No. S00980)，获取所有患者知情同意。

类器官原代培养：新鲜组织用 OM45 溶液保存并冰上转运，去除坏死 / 脂肪组织后清洗，剪碎为 1mm³ 碎片，用 OM41 酶消化 30 分钟(37℃摇床，每 10 分钟镜检避免过度消化)，100μm 滤网过滤后离心收集细胞，与 Matrigel(OM21)按 1:1 混合，以 70μL / 滴接种于 24 孔板，37℃固化 30 分钟后加入含 EGF、FGF7、FGF10 的优化培养基，每 2-3 天换液，4-6 天观察类器官形成(直径 > 100μm 为成功)。

类器官传代：机械破碎 Matrigel 获取类器官，用 OM43 温和消化 10 分钟至单细胞 / 小簇，离心后重悬于 DMEM，与 Matrigel 混合后重新接种，流程如图 6 所示。

表征验证：通过 H&E 染色评估组织架构，IHC 检测 8 种标志物(ER、PR、HER2、CK14、CK18 等)，IF 验证 CK18/CK14/Ki67/ERα 表达，qPCR 检测 GYN-1(生理性)和 GYN-4(激素相关性)的 KRT14、MKI67、ESR1 mRNA 水平，用 ImageJ 量化染色强度，GraphPad Prism 进行配对 t 检验。

实验结果

图 1：6 例患者术前评估与标本收集

该图展示患者术前临床资料与术中标本：包含术前正面 / 侧面照片(GYN-1 缺失正面照)、CT、超声图像及术中获取的乳腺腺体标本。图示明确样本的临床来源与术前诊断依据，确保后续类器官与疾病亚型的对应性。

图 2：患者基本特征与激素水平

该图为 6 例患者的年龄、BMI 及血清激素(FSH、LH、催乳素、睾酮等)数据表格，标注参考范围。例如 GYN-4 睾酮(0.63nmol/mL)低于正常(6.07-27.1nmol/mL)，GYN-6 催乳素(90.24ng/mL)显著升高，为激素相关性亚型提供依据，同时解释不同亚型的临床背景差异。

图 3：类器官原代培养流程示意图

该图分步展示从组织处理到接种的流程：组织清洗→剪碎→消化→过滤→Matrigel 包埋→培养。图示清晰标注关键步骤(如 1mm³ 碎片、OM41 消化、100μm 过滤)，为实验可重复性提供直观指导。

图 4：类器官长期培养的形态变化

该图为 6 例患者类器官在培养 1、6、14、25 天的明场图像，显示类器官从早期小簇逐步发育为球形 / 腺体样结构，直径随时间增大，无明显退化或污染。图示证明类器官在 25 天培养周期内的形态稳定性，支持其作为长期研究模型的可行性。

图 5：GYN-1 类器官的单日生长动态

该图为 GYN-1(生理性)类器官 1-9 天的明场图像，显示每日形态变化：从 Day1 的小细胞簇，到 Day9 的边界清晰、内部微结构(如管腔样区域)形成。图示直观呈现类器官的生长规律，证实其结构逐步成熟的过程。

图 6：类器官传代流程示意图

该图展示传代关键步骤：类器官收集→OM43 温和消化→终止消化→离心→Matrigel 重悬→重新接种。图示明确机械破碎与酶消化的配合方式，避免过度处理导致细胞损伤，确保传代后类器官的存活与增殖。

图 7：类器官与原组织的 H&E 染色对比

该图为 6 例患者类器官与原组织的 H&E 切片，显示两者均具备腺体样结构，如 GYN-2 类器官高倍镜下可见管腔样空间与上皮细胞簇(箭头标注)，核形态、细胞排列与原组织一致。图示直接证明类器官的组织架构保真度，是模型有效性的核心依据。

图 8：IHC 标志物表达验证

该图包含 6 例患者类器官与原组织的 8 种标志物(ER、PR、Ki67 等)IHC 染色及量化结果：染色强度热图显示各标志物在类器官与原组织中表达一致，量化图(B/C)显示无统计学差异。例如 ER 在激素相关性亚型(GYN-4-6)中表达略低，但仍与原组织匹配，HER2 均为阴性，排除恶性风险。

图 9：IF 验证与 ERα 蛋白降低

该图为 GYN-1/GYN-4 的 IF 染色(CK18 绿、Ki67 红、CK14 紫、ERα 橙)及量化：CK18/CK14/Ki67 荧光强度与原组织无差异，但 ERα 在类器官中显著降低(p<0.0001)。图示揭示 ERα 的蛋白水平变化，为后续体外激素微环境优化提供方向。

图 10：qPCR 转录水平验证

该图为 GYN-1(A)和 GYN-4(B)的 KRT14、MKI67、ESR1 mRNA 相对表达量，显示类器官与原组织无显著差异(p>0.05)。例如 GYN-4 的 ESR1 表达接近 1(以原组织为校准值)，证明 ERα 蛋白降低并非转录层面改变，而是 post-transcriptional 调控所致。

全文总结

本研究首次建立男性乳房发育症患者来源的类器官模型，通过标准化流程(组织消化、Matrigel 包埋、优化培养基)成功培养 6 例不同亚型(生理性、特发性、激素相关性)的类器官，验证其与原组织的形态(H&E 证实腺体架构)和分子(IHC/IF/qPCR 证实标志物一致)保真度，填补男性良性乳腺疾病体外建模的空白。关键发现包括：类器官保留基底 / 腔上皮细胞身份与增殖能力，ERα 蛋白降低但 ESR1 转录稳定(提示体外激素微环境可优化)，且培养 25 天内形态稳定。局限性在于缺乏正常男性乳腺组织对照、样本量较小(6 例)、未开展激素刺激功能实验及转录组分析。未来需通过补充雌激素 / 雄激素、构建 stromal 细胞共培养体系优化模型，结合单细胞测序解析亚型差异，最终将该模型用于发病机制研究(如激素调控机制)与个性化治疗筛选(如内分泌调节剂测试)，为男性乳房发育症的精准研究提供新平台。