多能干细胞衍生肝类器官（hPLO）模拟登革病毒感染及抗病毒药物筛选研究

登革病毒(DENV)是全球传播最快的蚊媒病毒，每年感染 1-4 亿人，WHO 已将其列为 “3 级紧急公共卫生事件”。然而，DENV 感染的发病机制仍不明确，且无获批抗病毒药物，现有研究模型存在显著缺陷：

动物模型：小鼠等动物与人类肝脏生理结构、免疫反应差异大，无法复现登革热重症肝损伤(如肝细胞坏死);

细胞系模型：Huh7 等永生细胞系缺乏肝脏细胞异质性和生理微环境，感染后仅出现轻微表型(如核碎裂)，无法模拟临床重症病理;

原代肝细胞模型：来源有限、长期培养易失活，难以用于感染动态和药物筛选研究。

肝脏是 DENV 感染的关键靶器官，临床中重症患者常伴随肝损伤(转氨酶升高、肝细胞坏死)，因此亟需一种能复现人类肝脏生理特征的体外模型。人多能干细胞(hPSC)衍生肝类器官(hPLO)因具备细胞异质性(肝细胞、胆管细胞、星状细胞)和肝脏功能(白蛋白分泌、尿素合成、CYP 酶活性)，成为解决上述问题的理想选择。本研究构建 hPLO 模型，用于 DENV 感染建模、发病机制解析及抗病毒药物筛选。

来自中国军事医学科学院、首都儿科研究所的团队在《Nature Communications》(2025 年，Vol. 16)发表题为Recapitulating dengue virus infection with human pluripotent stem cell-derived liver organoids for antiviral screening的研究。

核心内容如下：

(1)研究方法

1.hPLO 的构建与鉴定

分化流程：hPSC(hiPSC、H1/H9 hESC)经 “定形内胚层(DE)→肝定向分化(HS)→3D 类器官形成” 分阶段诱导：

2D 阶段(D0-D10)：用 Activin A、CHIR99021 诱导 DE，再用 bFGF、BMP4 诱导 HS;

3D 阶段(D10 后)：HS 细胞嵌入 Matrigel，用含 Wnt3a、R-spondin1、EGF 的培养基培养，25 天形成可扩展 hPLO，50 天形成成熟 hPLO;

鉴定方法：免疫荧光(检测 AFP/ALB/HNF4A 等肝细胞标志物、KRT7/KRT19 胆管标志物)、功能实验(ICG 摄取释放、PAS 糖原染色、CYP3A4/CYP2C9 酶活性)、scRNA-seq(细胞组成分析)。

2.DENV-2 感染实验

感染条件：25 天 hPLO(更易感染，形态变化显著)经机械解离为 30-100μm 片段，以 1 PFU / 片段接种 DENV-2(TSV01 株);

检测指标：形态观察、Live/Dead 染色(细胞死亡)、RT-qPCR(病毒 RNA)、空斑实验(病毒滴度)、免疫荧光(DENV 抗原定位)、TEM(病毒颗粒)。

3.scRNA-seq 分析

样本：感染后 1、2、8 天的 hPLO 及对照，共 59029 个高质量细胞;

分析工具：UMAP 聚类、GSVA 富集、伪时间分析，重点解析细胞组成变化、病毒分布及差异表达基因(DEGs)。

4.抗病毒药物筛选与验证

筛选库：含 7DMA(广谱抗病毒药)、JNJ1802(已知抗 DENV 药)及线粒体保护剂 ORES(氧化白藜芦醇)、RTA 408(NRF2 激活剂);

验证：hPLO 中检测药物对病毒复制(RT-qPCR)、肝功能(ALB 分泌、CYP 活性)的恢复作用，AG6 小鼠(IFNα/γR-/-)中验证药物体内 efficacy。

(2)关键结果

1.hPLO 的构建与功能验证

细胞组成：含 4 种主要细胞类型 —— 肝细胞样细胞(表达 ALB/HNF4A)、增殖肝细胞样细胞(表达 MKI67/PCNA)、胆管细胞样细胞(表达 KRT7/KRT19)、肝星状细胞样细胞(表达 PDGFRB/COL3A1)(图 1n-o);

肝功能：可摄取并释放 ICG(7-14h 完全释放)、储存糖原(PAS 染色阳性)、分泌白蛋白(ALB)和尿素，CYP3A4/CYP2C9 酶活性与原代肝细胞(PHHs)相当(图 2g-k)。

2.hPLO 对 DENV-2 的易感性

形态变化：感染后 2 天，hPLO 从空心透明球体变为实心小体，6 天 90% 类器官失去健康形态(图 3b-c);

细胞死亡：感染后 4 天，Live/Dead 染色显示大量红色死亡细胞，对照几乎全为绿色活细胞(图 3d);

病毒复制：感染后 2-8 天，病毒 RNA 和滴度显著升高(RNA 增加 10³ 倍，滴度达 10⁶ PFU/mL)，TEM 观察到病毒颗粒，DENV 抗原广泛分布于肝细胞样和增殖肝细胞样细胞(图 3e-g、3h-j)。

3.scRNA-seq 揭示感染机制

靶细胞：增殖肝细胞样细胞是主要感染靶细胞，感染后 8 天其比例下降 10%，而胆管 / 星状细胞比例分别增加 5%/10%(图 4d-g);

分子机制：感染后肝细胞样细胞中线粒体基因(MT-CO1/2/3、MT-CYB)表达下调，氧化应激相关基因(H19)上调，NRF2 通路下游抗氧化基因(GPX1、C1QBP)下调，提示线粒体损伤和氧化应激是核心发病机制(图 5a、5d);

免疫反应：胆管 / 星状细胞中炎症反应(IL-1β/TNFα)、I 型干扰素通路(MX1、ISG15)激活，而肝细胞样细胞免疫反应薄弱，导致易感性更高(图 5g-i)。

4.抗病毒药物筛选与验证

候选药物：ORES(10μM)和 RTA 408(0.2μM)可显著恢复 hPLO 健康形态(健康比例从 10% 升至 60%)，降低病毒 RNA(下降 10²-10³ 倍)(图 6d-h、6j-m);

作用机制：激活 NRF2 通路，恢复下游抗氧化基因(HMOX1、GPX2)表达，减少氧化应激，保护线粒体功能，恢复肝糖原储存、CYP 活性及 ALB / 尿素分泌(图 6n-s);

体内验证：AG6 小鼠口服 ORES(60mg/kg)或 RTA 408(15mg/kg)后，肝脏和血清中 DENV RNA 显著降低(下降 50%-70%)(图 7d-e)。

实验结果

图 1：hPLO 的构建与细胞组成鉴定

该图核心是验证 hPLO 的成功构建及细胞异质性。(A)分化流程：hPSC→DE→HS→2D 到 3D 类器官(D10 启动 3D 培养，D25 可扩展，D50 成熟);(B-C)形态变化：D12-D18 从 20-30μm 空心球生长至 600-800μm，D25-D110 维持稳定形态;(D-F)免疫荧光：D25 hPLO 表达 AFP/ALB/HNF4A(肝细胞)、KRT7/KRT19(胆管细胞)、KI67(增殖)，D50 表达成熟肝细胞标志物 TF;(G-K)基因表达热图：分化过程中干细胞标志物(OCT4)下调，肝脏标志物(ALB、CYP3A4)上调;(N-O)scRNA-seq：UMAP 聚类显示 4 种细胞类型，_dot 图验证各细胞标志物(如肝细胞样细胞的 SERPINA1、星状细胞的 PDGFRB)。图示证明 hPLO 具备肝脏细胞异质性和分化成熟特征。

图 2：hPLO 的功能验证

该图证实 hPLO 的肝脏生理功能。(A-B)超微结构：TEM 观察到胆管细胞间紧密连接(ZO-1 阳性)和微绒毛，符合胆管结构;(C-F)功能实验：CDFDA 染色显示胆汁 canaliculi 形成(MRP2 活性)，Rhodamine 123 转运实验证实 MDR1 活性(Verapamil 可抑制)，ICG 7-14h 完全释放，PAS 染色显示糖原储存;(G-K)定量功能：D25/D50 hPLO 的 ALB / 尿素 / AAT 分泌量、CYP3A4/CYP2C9 活性与原代肝细胞相当。图示 hPLO 具备完整肝脏代谢和转运功能。

图 3：hPLO 感染 DENV-2 后的表型与病毒复制

该图直观展示感染后的病理变化。(A)实验设计：hPLO 片段接种 DENV-2(1 PFU / 片段);(B-C)形态量化：感染后 6 天 90% hPLO 变为实心小体，对照无变化;(D)Live/Dead 染色：感染组红色死亡细胞显著增多;(E-F)病毒定量：病毒 RNA 和滴度随时间升高;(G-J)免疫荧光：DENV 抗原(绿)与 HNF4A(肝细胞，红)、KI67(增殖，红)共定位，证实感染靶细胞。图示 hPLO 可复现 DENV 感染的临床病理特征。

图 4：scRNA-seq 的细胞聚类与感染动态

该图解析感染对细胞组成的影响。(A-B)UMAP 聚类：对照与感染组细胞分布差异显著，感染后 8 天变化最明显;(C)密度图：感染后 2 天细胞组成开始改变，8 天差异扩大;(D-G)细胞比例：增殖肝细胞样细胞比例下降 10%，胆管 / 星状细胞比例升高;(H-J)病毒分布：感染后 8 天 45% 肝细胞样 / 增殖肝细胞样细胞呈 DENV 阳性，胆管 / 星状细胞阳性率 35%。图示增殖肝细胞样细胞是主要靶细胞，感染导致细胞组成失衡。

图 5：感染后的发病机制(线粒体损伤与免疫反应)

该图揭示感染的分子机制。(A)DEG 分析：感染后肝细胞样细胞线粒体基因下调，氧化应激基因上调;(B-C)火山图：增殖肝细胞样细胞中 PLIN2(抗病毒)、NEAT1(线粒体应激)上调，线粒体基因下调;胆管细胞中 IFN 通路基因(IFI6、ISG15)上调;(D)GO 富集：增殖肝细胞样细胞上调基因富集 “病毒感染 / 凋亡”，下调基因富集 “线粒体呼吸链”;(G-L)功能评分：胆管 / 星状细胞炎症 / 干扰素评分高，肝细胞样细胞线粒体损伤评分高。图示线粒体损伤和免疫失衡是核心机制。

图 6：抗病毒药物筛选与功能恢复

该图展示药物筛选结果。(A)筛选流程：hPLO 感染后加药，检测形态、病毒量、肝功能;(B-C)阳性药验证：7DMA/JNJ1802 可恢复 hPLO 形态;(D-H)ORES 效果：10μM ORES 使健康类器官比例升至 60%，病毒 RNA 下降 10³ 倍;(I-M)RTA 408 效果：0.2μM RTA 408 同理;(N-S)机制验证：药物激活 NRF2 通路，恢复糖原储存、CYP 活性及 ALB / 尿素分泌。图示 ORES 和 RTA 408 是有效抗 DENV 药物。

图 7：细胞与动物模型的药物验证

该图验证药物的体外 / 体内 efficacy。(A-B)Huh7 细胞：ORES/RTA 408 显著降低病毒 RNA;(C)动物实验设计：AG6 小鼠预处理 2 天，感染后给药 5 天;(D-E)体内效果：药物处理组肝脏 / 血清病毒 RNA 下降 50%-70%。图示药物在细胞和动物模型中均有效。

全文总结

本研究首次构建了具备生理相关性的 hPSC 衍生肝类器官(hPLO)模型，解决了 DENV 感染研究中模型缺乏人体相关性的核心问题，核心创新点如下：

模型优势：hPLO 含 4 种肝脏细胞类型，具备完整肝功能，对 DENV-2 高度易感，可复现重症肝损伤(形态变化、细胞死亡)，优于传统细胞系和动物模型;

机制突破：通过 scRNA-seq 发现增殖肝细胞样细胞是 DENV 主要靶细胞，线粒体损伤和 NRF2 通路抑制是关键发病机制，为 DENV 肝损伤提供新靶点;

药物发现：筛选出 ORES 和 RTA 408 两种 NRF2 激活剂，可通过抗氧化、保护线粒体发挥抗 DENV 作用，在 AG6 小鼠中验证有效，为临床治疗提供候选药物。