TNFα 通过 ACSL1/JNK/ERK/NF-κB 信号通路诱导单核细胞中基质金属蛋白酶 - 9 的表达

Reporter THP1 Cell Line 细胞系是以 THP-1 为工具细胞，采用慢病毒感染的方式，构建稳定表达报告基因的细胞系，可用于检测信号通路转导。在被PMA、INF-α等刺激后，目标信号通路被激活，会启动下游特定基因的表达，这个表达过程会同时带动“报告基因”的表达。通过检测报告基因的信号强度，可以间接、定量、灵敏地衡量该信号通路的激活程度。

THP-1细胞本身来源于人单核细胞，可以分化为巨噬细胞样细胞，是研究先天免疫的经典模型。报告基因株的建立使其功能更强大。THP-1报告基因株是免疫学、炎症性疾病、药物研发等领域不可或缺的强大工具。它可以将一个复杂的、内在的生物学过程(信号通路激活/基因表达)转变为一个易于检测、可定量的物理信号(光或荧光)。这使得研究人员能够高通量地筛选药物，精确地量化免疫反应强度，直观地研究信号通路机制。

基本信息

英文标题：TNFα induces matrix metalloproteinase‑9 expression in monocytic cells through ACSL1/ JNK/ERK/NF‑kB signaling pathways

中文标题：TNFα 通过 ACSL1/JNK/ERK/NF-κB 信号通路诱导单核细胞中基质金属蛋白酶-9 的表达

发表期刊：《Scientific Reports》

影响因子：3.9

作者单位：

1.Immunology and Microbiology Department, Dasman Diabetes Institute, Kuwait City, Kuwait

2.Bioenergetic Department, Dasman Diabetes Institute, 15462, Dasman, Kuwait

3.Enfants Malades (INEM), INSERM U1151/CNRS UMRS8253, IMMEDIAB, Université de Paris Cité, 75015, Paris, France

作者信息：

Areej Al‑Roub、Nadeem Akhter、Fatema Al‑Rashed、Ajit Wilson、Fawaz Alzaid,通讯作者：Rasheed Ahmad

研究背景

基质金属蛋白酶 - 9(MMP-9)过度表达与肥胖相关炎症、胰岛素抵抗、癌症转移等疾病密切相关，单核细胞 / 巨噬细胞是其主要分泌来源。肿瘤坏死因子 α(TNFα)在肥胖等炎症状态下水平升高，可诱导 MMP-9 表达，但具体分子机制尚未完全阐明。长链酰基辅酶 A 合成酶 1(ACSL1)已被证实参与 TNFα 介导的炎症反应，本研究旨在探究 ACSL1 在 TNFα 诱导单核细胞 MMP-9 表达中的作用及下游信号通路，为炎症相关疾病的治疗提供新靶点。

研究方法

采用 THP-1 单核细胞和人原代单核细胞为研究对象，通过 TNFα 刺激诱导 MMP-9 表达;使用 ACSL1 抑制剂(triacsin C)、β- 氧化抑制剂(etomoxir)、神经酰胺合成抑制剂(myriocin)预处理细胞，或通过 siRNA 敲低 ACSL1 表达，结合 JNK、ERK、NF-κB 通路抑制剂，探究信号通路机制。采用 qRT-PCR 检测 MMP-9 mRNA 水平，ELISA 检测分泌型 MMP-9 蛋白，Western blot 检测 ACSL1 及通路蛋白(p-JNK、p-ERK1/2、p-NF-κB p65 等)的磷酸化水平，MTT 法检测细胞活力，NF-κB/AP-1 报告基因 assay 评估转录因子活性。数据采用 GraphPad Prism 分析，组间比较用 t 检验或单因素 ANOVA，P<0.05 为差异有统计学意义。

实验结果

图 1：TNFα 诱导单核细胞中 MMP-9 的表达

TNFα(10 ng/ml)处理 24 小时后，THP-1 细胞和人原代单核细胞的 MMP-9 mRNA 和蛋白水平均显著升高(P<0.001)，效果与阳性对照 LPS 相当;THP-1 细胞中 MMP-9 的表达呈时间依赖性，从 2 小时开始升高，24 小时达峰值，证实 TNFα 可有效诱导单核细胞 MMP-9 表达。

图 2：ACSL1 抑制降低 TNFα 诱导的 MMP-9 产生

ACSL1 抑制剂 triacsin C 预处理可显著抑制 TNFα 诱导的 THP-1 细胞 MMP-9 mRNA 和蛋白表达(P<0.001);而 β- 氧化抑制剂 etomoxir 和神经酰胺合成抑制剂 myriocin 对 MMP-9 表达无明显影响;各抑制剂联合 TNFα 处理不影响细胞活力，排除细胞毒性干扰，表明 TNFα 诱导 MMP-9 依赖 ACSL1，与 β- 氧化和神经酰胺合成无关。

图 3：ACSL1 siRNA 敲低抑制 TNFα 介导的 MMP-9 产生

ACSL1 siRNA 转染后，THP-1 细胞中 ACSL1 mRNA 和蛋白水平降低 > 50%(P<0.01);与 scramble siRNA 组相比，ACSL1 敲低细胞经 TNFα 刺激后，MMP-9 mRNA 和蛋白表达显著减少(P<0.001)，细胞活力无明显变化，进一步证实 ACSL1 是 TNFα 诱导 MMP-9 表达的关键分子。

图 4：ACSL1 通过 JNK/ERK/NF-κB 通路调控 MMP-9 表达

JNK 抑制剂(SP600125)、ERK 抑制剂(PD98059、U0126)及 NF-κB 抑制剂(Bay 11–7085 等)均可显著抑制 TNFα 诱导的 MMP-9 mRNA 和蛋白表达(P<0.01);triacsin C 预处理可显著降低 TNFα 诱导的 p-JNK(p54/46)、p-c-Jun、p-ERK1/2(p44/42)及 p-NF-κB p65 的磷酸化水平(P<0.01)，表明 ACSL1 位于 JNK/ERK/NF-κB 通路上游，介导其激活。

图 5：ACSL1 抑制减少 TNFα 诱导的 NF-κB/AP-1 激活

TNFα 处理可显著激活 NF-κB/AP-1 报告基因活性(P<0.0001)，同时上调 MMP-9 mRNA 和蛋白表达;triacsin C 预处理可显著抑制 TNFα 诱导的 NF-κB/AP-1 激活(P<0.001)，并同步降低 MMP-9 表达，而 etomoxir 和 myriocin 无此效果，证实 ACSL1 通过激活 NF-κB/AP-1 转录因子，调控 MMP-9 基因转录。

研究结论

本研究证实 TNFα 可在 THP-1 细胞和人原代单核细胞中诱导 MMP-9 的表达，其机制依赖 ACSL1 介导的 JNK/ERK/NF-κB 信号通路激活，与脂肪酸 β- 氧化及神经酰胺合成无关。ACSL1 通过激活 JNK、ERK1/2 的磷酸化，促进 NF-κB p65 磷酸化及核转录，进而上调 MMP-9 表达。该发现揭示了 TNFα 诱导 MMP-9 表达的全新分子机制，明确 ACSL1 为关键调控节点，为肥胖相关炎症、癌症转移等 MMP-9 过度表达相关疾病的治疗提供了潜在靶点。