多模态标本来源患者类器官的生成与应用 protocol 研究

患者来源类器官(PDOs)是精准肿瘤学的重要预临床模型，但现有方案多依赖手术切除标本，难以覆盖无法手术的晚期或局部进展期患者。临床中，内镜超声引导细针活检(EUS-FNB)、经皮肝活检(PLB)等微创活检标本，以及腹水、胸腔积液等液体标本更易获取，却因细胞量少、成分复杂(含免疫细胞、红细胞)，缺乏标准化 PDO 构建流程。本研究建立了一套适用于多模态标本(手术组织、微创活检、体液)的 PDO 生成与应用 protocol，涵盖标本运输、肿瘤细胞分离、培养、生物保藏及高通量药物筛选，解决了非手术患者 PDO 建模的技术瓶颈，推动 PDO 在多样化临床场景中的转化应用。

来自韩国国家癌症中心的团队在《STAR Protocols》(2025 年，Vol. 6)发表了题为Protocol for generation and utilization of patient-derived organoids from multimodal specimen的研究。

核心内容如下：

研究方法：

标本类型与处理流程：

手术组织：切除后去除正常组织(如脂肪、肌肉)，剪碎(0.5×0.5 cm)，用 Miltenyi 肿瘤解离试剂盒 + gentleMACS Octo 解离仪(37℃，30-40 min，按肿瘤硬度选程序)，离心洗涤后用基底膜提取物(BME)包埋，24 孔板每孔 40μL dome 接种;

微创活检(EUS-FNB/PLB/ 穿刺活检)：标本用转移培养基洗涤，无菌剪刀切碎，加少量解离酶(Enzyme H/R/A)37℃旋转孵育 15 min，红细胞裂解(按需)后 BME 包埋;

液体活检(腹水 / 胸腔积液)：400×g 离心 10 min，Ficoll 密度梯度离心分离单核细胞层(含肿瘤细胞)，洗涤后 BME 包埋。

培养体系优化：

基础培养基：Advanced DMEM/F12+ B-27、GlutaMAX 等;

癌症特异性补充剂：口腔癌加毛喉素，胰腺癌 / 胆管癌加胃泌素，结直肠癌加 SB202190+N2，确保不同癌症 PDO 的增殖能力。

保藏与质量控制：

冻存：对数期 PDO 用含 5% DMSO、10% 热灭活 FBS 的冻存液，-80℃过夜后转液氮;

复苏：37℃水浴 1 min，洗涤后 BME 包埋，加 50μM Y-27632(前 3 天);

质控：解冻后 7 天用 LIVE/DEAD 染色测活力(≥60% 为合格)，STR 分析验证遗传一致性，支原体 PCR 检测污染。

高通量药物筛选：

384 孔板接种(1000 细胞 / 孔，含 10% BME)，培养 3 天后加 2× 药物浓度(5 个剂量 + 对照，4 复孔)，孵育 5 天后用 CellTiter-Glo 3D 测活力，计算 IC50 和 AUC。

关键结果：

多标本适配性：成功从 6 种癌症(口腔癌、胰腺癌、结直肠癌等)的多模态标本生成 PDO，手术组织 PDO 建立成功率约 70%，活检标本约 50%，液体标本约 40%;

形态与遗传一致性：PDO 保留原发肿瘤形态(如胆管癌呈葡萄状，结直肠癌呈囊性)，STR 分型与原组织匹配率 > 95%;

药物筛选有效性：384 孔板筛选的 Z'- 因子 > 0.5，IC50 与患者临床响应趋势一致(如 KRAS 突变胰腺癌对 MEK 抑制剂敏感);

长期保藏：液氮保存 24-36 个月的 PDO 解冻后活力仍达 60%-80%，可正常传代。

实验结果

图 1：多模态标本处理流程示意图

该图展示不同标本的 PDO 构建核心步骤。(A)手术组织：剪碎→酶解 + 机械解离→离心洗涤;(B)活检标本：剪碎→酶孵育→离心洗涤;(C)液体活检：离心→Ficoll 密度梯度分离→离心洗涤。图示清晰区分三类标本的关键差异(如液体标本需密度梯度分离)，为标准化操作提供可视化指南。

图 2：手术组织标本处理步骤

该图细化手术组织的预处理。(A)去除正常组织(如脂肪)，保留肿瘤区域;(B)肿瘤切成 0.5×0.5 cm 小块;(C)剪至糊状以提高酶解效率。图示强调 “去正常化” 和 “充分剪碎” 对肿瘤细胞得率的重要性，避免非肿瘤细胞干扰 PDO 形成。

图 3：PDO 在基质中的生长景观

该图显示 PDO 与基质成分的关系。(A)酶解后残留的纤维成分与肿瘤细胞;(B)肿瘤细胞在基质中形成 PDO(白色箭头)，基质组织(黑色箭头)作为支撑。图示说明省略过滤步骤可减少肿瘤细胞损失(尤其标本量少时)，且基质不影响 PDO 生长。

图 4：BME 内细胞分布观察

展示 BME 中可能出现的成分：(A)单肿瘤细胞(PDO 形成基础);(B)类器官雏形(细胞早期聚集);(C)组织碎片间肿瘤细胞(无需过滤避免损失);(D)退化分化组织;(E)干扰性免疫细胞;(F)需移除的大气泡。助力快速识别有效肿瘤成分与干扰因素。

图 5：液体活检标本的肿瘤细胞分离流程

该图详解体液中肿瘤细胞的获取。(A-B)腹水 / 胸腔积液离心获细胞 pellet;(C)将细胞悬液铺于 Ficoll 层(避免混合);(D-E)离心后吸取单核细胞层(含肿瘤细胞);(F-H)洗涤后 BME 包埋。图示关键在于 “梯度离心的层间不混合” 和 “单核细胞层的精准吸取”，确保肿瘤细胞纯度。

图 6：PDO 建立成功与失败的形态对比

该图提供结果判断标准。(A-E)失败案例：无肿瘤细胞生长(A)、分化组织碎片(B)、免疫细胞过多(C)、成纤维细胞过度生长(D)、细胞接种过密(E);(F-J)成功案例：PDO 增殖(F-G)、基质中 PDO(H)、组织碎片转化为 PDO(I)、免疫细胞与 PDO 共存(J)。图示帮助研究者快速识别培养状态，及时调整操作(如成纤维细胞过度时需分离传代)。

图 7：可传代 PDO 的典型形态

该图展示适用于传代的 PDO 特征。不同癌症 PDO(如口腔癌 HPT#25、胆管癌 OC#62)直径达 150-300 μm，密度约 50% 视野覆盖，形态致密或囊性。图示提供传代时机判断依据(如葡萄状 PDO 直径≥150 μm、囊性 PDO≥300 μm 时传代)。

图 8：类器官传代实操步骤

展示传代全流程：(A)显微镜观察筛选待传代类器官;(B)收获类器官后，通过物理刮擦(管壁摩擦)+ 化学酶解(TrypLE)实现解离;(C-E)逐步解离为单细胞;(F)计数后按密度(3×10³-5×10³ 细胞 / 40μL BME)接种，凝胶凝固后加培养基。明确解离关键(刮擦提升效率、避免酶解损伤)与接种标准，保障传代后类器官稳定生长。

图 9：高通量药物筛选实验设计

该图呈现药物筛选的操作流程与布局。(A)时间线：接种→培养 3 天→加药→培养 5 天→活力检测;(B)384 孔板布局：14 种药物，每种 5 个剂量 + 对照，4 复孔，边缘孔加 PBS 防蒸发。图示确保筛选的高通量与重复性，Z'- 因子 > 0.5 验证实验可靠性。

图 10：多模态标本的实物与 PDO 对应

该图展示不同标本类型的来源。包括手术组织、液体活检(腹水 / 胸腔积液)、PLB、EUS-FNB、穿刺活检，图示直观体现本 protocol 的标本覆盖范围，尤其突出微创和体液标本的临床可及性。

图 11：PDO 传代后生长时序

记录传代后动态：(1 天)单细胞 / 小细胞团;(3 天)早期类器官(直径～50μm);(5 天)形态清晰(如结直肠癌呈囊性);(7 天)达传代标准(直径 150-200μm，密度 50% 视野覆盖)。明确生长规律与传代时机。

图 12：不同癌症 PDO 的形态差异

该图呈现癌症特异性形态。口腔癌 PDO 呈致密状，胃癌呈囊性，胆管癌呈葡萄状，胰腺癌呈不规则状，且标注标本来源(如 PLB、腹水)。图示说明 PDO 形态与癌症类型的关联性，可作为初步鉴定依据。

图 13：冻存 PDO 的复苏质量控制

该图验证长期保藏效果。冻存 24-36 个月的 PDO 解冻后，LIVE/DEAD 染色显示活细胞(绿色)占比 60%-80%，活力量化结果与形态一致(如 SOC#26T 活力 80%，GUN#98 活力 < 60% 判定为失败)。图示确立冻存 PDO 的质控标准，保障生物库的可靠性。

全文总结

本研究建立了首套覆盖多模态标本(手术、微创活检、体液)的 PDO 标准化 protocol，核心创新在于：1)针对不同标本特性优化处理流程(如活检的温和酶解、液体标本的密度梯度分离)，突破非手术患者的建模限制;2)提供癌症特异性培养配方，确保 PDO 的增殖与形态保真;3)整合冻存 - 复苏 - 质控体系，支持 PDO 生物库建设;4)开发 384 孔高通量药物筛选方法，适配临床精准用药需求。

局限性包括：1)标本中肿瘤细胞占比 < 10% 时成功率显著下降;2)口腔癌、胰腺癌标本易受微生物污染;3)未覆盖血液系统肿瘤。未来可结合磁珠分选富集肿瘤细胞、添加抗生素减少污染，拓展至更多癌症类型。

该 protocol 为 PDO 在临床转化中的普及提供了实用工具，尤其适合无法手术的晚期患者，可实现 “标本获取 - 建模 - 药物筛选” 的全流程标准化，推动精准肿瘤学从 “手术标本依赖” 向 “多场景适配” 升级。