RPA1 通过抑制 DNA 损伤诱导的 PANoptosis 保护肢体发育研究

胚胎发育过程中大量细胞增殖伴随基因组不稳定性风险，可能导致发育缺陷，但维持基因组稳定的机制尚未完全阐明。肢体发育依赖间充质干细胞(MSCs)的快速增殖，此阶段 DNA 损伤响应(DDR)异常会引发肢体畸形(如沙利度胺导致的四肢缺失综合征)。复制蛋白 A1(RPA1)作为 DDR 核心因子，通过结合单链 DNA 参与 DNA 复制和修复，但其在肢体发育中的具体作用未知。本研究以早期肢体发育为模型，揭示 RPA1 通过抑制 DNA 损伤诱导的 PANoptosis(一种融合凋亡、坏死性凋亡和焦亡的炎症性细胞死亡)维持基因组稳定的机制，为理解先天性肢体缺陷提供新视角。

来自四川大学华西口腔医学院的团队在《Science Advances》(2025 年，Vol. 11)发表了题为RPA1 protects DNA damage–induced PANoptosis in limb development的研究。

核心内容如下：

研究方法：

动物模型：构建 Prrx1-Cre;Rpa1fl/fl 条件敲除(CKO)小鼠，特异性缺失肢体芽间充质细胞中的 RPA1;构建 Rpa1/Zbp1 双敲除(DKO)小鼠验证 ZBP1 的作用;

细胞实验：分离 E12.5 小鼠肢体芽 MSCs，通过 siRNA 敲低 RPA1，结合细胞活力检测、流式细胞术和 Western blot 分析细胞死亡类型;

分子机制：利用免疫荧光、共沉淀、CRISPResso2 分析等技术，检测 DNA 损伤(γ-H2AX、微核)、cGAS-STING 通路激活、Z-DNA 积累及 ZBP1 介导的 PANoptosis 相关分子(caspase-1/3/8、RIPK3、MLKL);

测序分析：结合单细胞 RNA 测序(scRNA-seq)分析 DDR 基因在小鼠和人类胚胎肢体中的表达模式。

关键结果：

表型缺陷：RPA1 条件敲除导致小鼠前肢几乎完全缺失、后肢严重发育不全，骨骼染色显示肱骨、尺骨等关键骨骼缺失，类似人类四肢缺失综合征;

细胞死亡：RPA1 缺失引发 MSCs 大量死亡，且为 PANoptosis(单独抑制凋亡、坏死性凋亡或焦亡无法阻断死亡，联合抑制有效);

分子机制：RPA1 缺失导致 DNA 损伤积累，激活 cGAS-STING 通路，诱导 ZBP1 表达;同时 RPA1 缺失促进 Z-DNA 积累，ZBP1 结合 Z-DNA 后激活 PANoptosome 复合体，触发细胞死亡;

挽救实验：敲除 ZBP1 或抑制 cGAS 可显著减少细胞死亡，部分挽救肢体发育缺陷。

实验结果

图 1：RPA1 在早期肢体发育中的表达模式

该图揭示 RPA1 的时空表达特征。(A)小鼠胚胎肢体间充质细胞的单细胞 UMAP 聚类，显示 14 个亚群;(B)小提琴图表明 E9.5-E11.5(肢体快速增殖期)DDR 基因评分和细胞周期评分显著升高;(C)热图显示 DDR 基因在该阶段高表达;(D-E)小鼠和人类胚胎肢体中 RPA1 表达在增殖期(小鼠 E9.5-E11.5，人类 PCW5.4-6.5)显著上调;(F)免疫荧光证实 E11.5 小鼠肢体中 RPA1 广泛表达，E12.5 后局限于远端增殖区。图示 RPA1 在肢体发育关键期高表达，提示其重要作用。

图 2：RPA1 缺失导致肢体发育缺陷

该图展示 RPA1 条件敲除的表型。(A)新生小鼠(P0)表型：CKO 小鼠前肢几乎缺失，后肢严重短小;(B-C)骨骼染色显示 CKO 小鼠缺失肱骨、尺骨等，指骨数量减少;(D-E)E12.5-E18.5 胚胎肢体芽逐渐变小，缺陷随发育加剧;(F-G)CKO 小鼠同时存在颅骨畸形(血肿和脑膨出)。图示 RPA1 对肢体和颅骨发育至关重要。

图 3：RPA1 缺失引发细胞死亡

该图验证细胞死亡表型。(A)RNA-seq 火山图显示 RPA1 敲低后 136 个基因上调(含 Zbp1 等干扰素刺激基因)，25 个下调;(B)基因富集分析显示干扰素调控通路激活;(C)qPCR 验证 Zbp1、Ddx60 等上调;(D-F)CK8 检测和 PI 染色显示 RPA1 敲低细胞活力下降，死亡增加;(G-J)E12.5 CKO 小鼠肢体芽中 AO 和 TUNEL 阳性细胞显著增多。图示 RPA1 缺失导致细胞死亡增加。

图 4：RPA1 缺失诱导 PANoptosis

该图明确细胞死亡类型。(A-C)单独使用坏死性凋亡抑制剂(Nec-1)、焦亡抑制剂(MCC950)或凋亡抑制剂(zVAD-fmk)无法阻断细胞死亡，联合抑制(N+M+Z)显著减少死亡;(D-E)Western blot 显示 RPA1 敲低细胞和 CKO 肢体芽中，焦亡(caspase-1/11、GSDME)、凋亡(caspase-3/7/8)和坏死性凋亡(pMLKL、pRIPK3)相关分子均激活。图示 RPA1 缺失引发 PANoptosis。

图 5：ZBP1 介导 RPA1 缺失诱导的 PANoptosis

该图揭示 ZBP1 的关键作用。(A-B)Western blot 证实 CKO 肢体芽和 RPA1 敲低细胞中 ZBP1 上调;(C-D)敲低 ZBP1 显著减少 RPA1 缺失导致的细胞死亡;(E)共沉淀显示 RPA1 缺失时 ZBP1 与 caspase-1、RIPK3 结合形成 PANoptosome;(F)敲低 ZBP1 抑制 PANoptosis 相关分子激活;(G-I)ZBP1 敲除可减少 CKO 小鼠肢体芽细胞死亡，部分挽救 E16.5 肢体发育缺陷。图示 ZBP1 是 RPA1 缺失诱导 PANoptosis 的核心介质。

图 6：cGAS-STING 通路激活参与 ZBP1 上调

该图解析上游信号。(A-B)RPA1 敲低细胞中 cGAS 在微核聚集，cGAS 抑制剂 RU.521 可阻断此现象;(C-H)RU.521 不影响 DNA 损伤(微核、γ-H2AX、彗星实验尾矩)，但(I-J)抑制 STING 磷酸化和 ZBP1 上调，减少 PANoptosis 相关分子激活。图示 cGAS-STING 通路通过上调 ZBP1 参与 RPA1 缺失诱导的细胞死亡(不影响 DNA 损伤本身)。

图 7：Z-DNA 积累激活 ZBP1

该图揭示 ZBP1 激活的最终触发因素。(A-B)RPA1 敲低细胞中 Z-DNA(而非 Z-RNA)积累，DNase I 处理可减少 Z-DNA 信号;(C)超分辨显微镜显示 ZBP1 与 Z-DNA 共定位;(D-H)STING 激活剂 cGAMP 可诱导 ZBP1 表达但不引起 Z-DNA 积累，也不触发细胞死亡。图示 Z-DNA 积累是 ZBP1 激活的必要条件，仅 ZBP1 上调不足以引发 PANoptosis。

全文总结

本研究发现 RPA1 在肢体发育中通过维持基因组稳定抑制异常细胞死亡：RPA1 缺失导致 DNA 损伤积累，激活 cGAS-STING 通路诱导 ZBP1 表达，同时促进 Z-DNA 积累;ZBP1 结合 Z-DNA 后激活 PANoptosome，引发间充质干细胞 PANoptosis，最终导致肢体发育缺陷。

创新点在于：首次揭示 PANoptosis 在胚胎发育异常中的作用;阐明 “cGAS-STING 上调 ZBP1+Z-DNA 激活” 的双步骤机制;发现 RPA1 作为肢体发育关键基因组守护者的新功能。局限性包括未明确 RPA1 缺失如何导致 Z-DNA 积累，以及缺乏人类样本验证。未来可探究 Z-DNA 形成的分子细节，为先天性肢体缺陷提供潜在治疗靶点。