无支架 3D 乳腺类器官模型用于乳腺癌癌变进展研究

乳腺癌研究中，3D 细胞模型虽能更好复现体内微环境，但传统凝胶包埋类器官存在变异性大、基质吸附生长因子干扰实验等问题;而无支架模型(如悬滴法)虽便于培养基交换和处理干预，却难以实现正常乳腺上皮细胞的器官型分化。此外，乳腺癌癌变进展涉及上皮 - 间质转化(EMT)、上皮 - 间质细胞相互作用等复杂过程，现有模型难以精准模拟且缺乏量化评估标准。本研究旨在建立一种高可重复性的无支架 3D 乳腺类器官模型，用于研究微环境因素(如 TGF-β、缺氧、间质细胞)对乳腺癌癌变进展的影响，并提供可量化的形态和表型参数，填补现有模型的不足。

来自美国密歇根大学等机构的 Sabra I. Djomehri、Celina G. Kleer 团队在《Journal of Cell Communication and Signaling》(2018 年)发表了题为A reproducible scaffold-free 3D organoid model to study neoplastic progression in breast cancer的研究。

核心内容如下：

研究方法：

细胞与培养系统：采用 384 孔悬滴系统，以非致瘤性乳腺上皮细胞 MCF10A、乳腺癌细胞 MDA-MB-231 为研究对象，优化培养基(含 1.5-2% Matrigel、10% FBS、0.24% 甲基纤维素)实现 “一滴一类器官”;

癌变诱导：通过 TGF-β(EMT 诱导剂)、CoCl₂(缺氧模拟剂)处理 MCF10A 类器官，或与 DsRed 标记的间充质干细胞(MSC)共培养，模拟癌变微环境;

原发肿瘤类器官：从 MMTV-Cre;Ccn6fl/fl 小鼠的原发化生乳腺癌组织中分离细胞，构建无支架类器官;

检测与量化：通过 H&E 染色、免疫荧光(CK5/6、CK18、E - 钙粘蛋白、波形蛋白等)、Western blot 检测细胞表型，ImageJ 量化类器官直径、球形度、中空度及阳性细胞比例。

关键结果：

类器官特征：MCF10A 在悬滴系统中形成直径约 1070±105 μm 的类器官，含中空腔室和次级腺泡，表达基底标志物 CK5/6(基底侧)和腔面标志物 CK18/E - 钙粘蛋白(顶端)，类似正常乳腺终末导管小叶单位(TDLU);

癌变模拟：TGF-β/CoCl₂处理后，类器官失去 E - 钙粘蛋白表达、上调波形蛋白(EMT 特征)，并新增胶原 I 合成(纤维化表型);与 MSC 共培养导致类器官结构紊乱、腺泡消失、出现梭形细胞;

原发肿瘤适配性：小鼠原发乳腺癌类器官保留原发肿瘤的高分级梭形细胞形态，表达增殖标志物 Ki67 和凋亡标志物 Cleaved Caspase 3;

量化标准：建立形态(直径 > 800 μm 为器官型分化，球形度 <0.5 为癌变表型)和表型(E - 钙粘蛋白 +>50% 为上皮型，胶原 I+>50% 为纤维化)的量化参数，可区分正常、致瘤性和癌变类器官。

实验结果

图 1：MCF10A 细胞在悬滴系统中的器官型扩张

该图验证类器官与正常乳腺组织的相似性。(A)上图：对比正常人类乳腺 TDLU(左)与 MCF10A 类器官(右)的发育过程，类器官第 16 天表达 E - 钙粘蛋白，形成中空腔室和次级腺泡(白色箭头);下图：H&E 染色显示类器官内部腺泡结构，免疫荧光证实基底标志物 CK5/6(绿)和腔面标志物 CK18(红)的极性分布，类似正常 TDLU;(B)示意图对比传统凝胶包埋(左，小腺泡)、超低吸附板(中，细胞聚集)与悬滴系统(右，大尺寸类器官)的差异，明确悬滴系统的器官型分化优势。图示 MCF10A 类器官可复现正常乳腺的结构和细胞异质性。

图 2：类器官培养条件的优化

该图筛选最优培养参数。(A)明场和 H&E 显示：96 孔超低吸附板(ULA)中 MCF10A 仅形成松散聚集，而 384 孔悬滴(HD)加 10% FBS 可形成致密类器官;(B)Matrigel 浓度优化：0% Matrigel 仅形成细胞团，1-2% Matrigel 可诱导分化，1.5% 时类器官形成效率达 95%;(C)生长曲线：MCF10A 类器官每 4 天直径增加 75%，共培养和肿瘤类器官生长稍慢，无 Matrigel 组(10A MG⁻)4 天后停止增殖。图示 1.5% Matrigel+10% FBS 是悬滴系统的最优条件。

图 3：不同细胞来源的类器官特征对比

该图区分正常与癌变类器官表型。(左)正常人类 TDLU 和侵袭性导管癌的组织学特征;(中)MCF10A 类器官：H&E 显示中空腔室，免疫荧光阳性表达 E - 钙粘蛋白(上皮)、CK5/6(基底)、CK18(腔面);(右)MCF10A MG⁻(无 Matrigel)：仅形成细胞团，无组织特异性标志物;MDA-MB-231(乳腺癌)类器官：不规则形态，E - 钙粘蛋白缺失，类似侵袭性癌。图示悬滴系统可区分正常、非分化和癌变类器官的结构差异。

图 4：EMT 诱导后的类器官标志物变化

该图验证癌变相关表型转换。共聚焦显示：未处理 MCF10A 类器官高表达 E - 钙粘蛋白(红)、低表达波形蛋白(绿);TGF-β 或 CoCl₂处理后，E - 钙粘蛋白显著减少，波形蛋白大量上调，符合 EMT 特征(上皮向间质转化，癌变关键步骤)。图示悬滴系统可模拟乳腺癌癌变中的 EMT 过程。

图 5：处理与共培养对类器官表型的影响

该图探究微环境因素的作用。(A)胶原 I 染色：TGF-β/CoCl₂处理后，MCF10A 类器官胶原 I⁺细胞比例显著增加，接近 MDA-MB-231 和 MSC 共培养组，提示纤维化表型(癌变相关);(B)MSC 共培养：H&E 显示类器官腔室填充，免疫荧光显示 CK5/6 表达紊乱，MCF10A 细胞呈梭形，失去上皮特征;(C)小鼠原发肿瘤类器官：明场显示梭形细胞，H&E 和免疫荧光证实 Ki67⁺增殖细胞和 Cleaved Caspase 3⁺凋亡细胞，保留原发肿瘤的高分级形态。图示悬滴系统可模拟上皮 - 间质相互作用和原发肿瘤特征。

图 6：类器官形态与表型参数的量化分析

该图建立标准化评估体系。(A)量化结果：形态参数(直径、球形度、中空度)和表型参数(E - 钙粘蛋白⁺、梭形细胞⁺、CK5/6⁺、胶原 I⁺)在不同组间差异显著(P<0.001)，如 MCF10A 球形度> 0.87(球形)、中空度 > 0.91(中空)，MDA-MB-231 球形度 < 0.3(不规则)、中空度 < 0.56(填充);(B)参数表：总结各细胞类型的形态(直径、球形度、中空度)和表型(上皮、间质、基底、纤维化)特征，如 MCF10A 为 “大直径、球形、中空、上皮型”，MDA-MB-231 为 “中直径、不规则、填充、间质型”。图示该模型可通过量化参数标准化评估癌变进展。

全文总结

本研究建立了基于 384 孔悬滴系统的无支架 3D 乳腺类器官模型，核心优势包括：1)高可重复性：“一滴一类器官”，形态和表型变异小，可量化评估(直径、球形度等参数);2)功能模拟：MCF10A 类器官复现正常乳腺 TDLU 结构，TGF-β/CoCl₂或 MSC 共培养可诱导癌变相关的 EMT 和纤维化表型;3)临床适配性：支持小鼠原发乳腺癌类器官构建，保留原发肿瘤形态，可用于研究癌变微环境;4)无基质干扰：避免凝胶包埋的生长因子吸附问题，便于药物筛选和信号通路研究。

局限性包括：缺乏体内 ECM 的生物物理信号(如机械力)，长期培养(>16 天)易出现脱水或形态紊乱;未验证人类患者原发肿瘤类器官的适用性。未来可结合 ECM 模拟信号(如弹性基质)、延长培养周期，并拓展至人类患者样本，推动其在乳腺癌精准医学(如药物敏感性检测)中的应用。