引导编辑精准纠正 iPSC 中的 G6PD Viangchan 突变研究

葡萄糖 - 6 - 磷酸脱氢酶(G6PD)缺乏症是一种常见的遗传性酶缺陷病，患者在氧化应激下易发生严重溶血危机，目前尚无根治方法。在超过 200 种 G6PD 突变中，Viangchan 突变(c.871G>A)在东南亚地区最为流行，可导致酶活性降至正常的 10% 以下，患者对氧化触发因素高度敏感。传统基因编辑技术(如 CRISPR-Cas9)可能引发 DNA 双链断裂和随机插入缺失(indels)，而引导编辑(prime editing)作为精准的 CRISPR 衍生技术，无需双链断裂即可实现碱基替换，为纠正该突变提供了新工具。本研究旨在评估引导编辑对 G6PD Viangchan 突变的纠正效率和特异性，为其临床应用和疾病模型构建奠定基础。

来自泰国朱拉隆功大学的团队在《Scientific Reports》(2025 年，Vol. 15)发表了题为Precise correction of G6PD Viangchan mutation in iPSCs by prime editing strategy的研究。

核心内容如下：

研究方法：

细胞模型构建：在 HEK293T 细胞中通过引导编辑安装 G6PD Viangchan 突变，建立突变模型;

引导编辑优化：设计并优化引导编辑向导 RNA(epegRNA)，测试不同引物结合位点(PBS，12-14 nt)和逆转录模板(RTT，18-25 nt)长度，以及次级切口 sgRNA 的位置(-56 至 + 80 bp)，采用 PE3 系统(含 Cas9 nickase 和逆转录酶融合蛋白);

效率评估：在突变 HEK293T 细胞和 G6PD 缺陷 iPSC(CHULAi001-A)中，通过 Sanger 测序(TIDER 分析)和下一代测序(NGS)量化纠正效率及 indels 比例;

脱靶分析：对预测的 epegRNA 和 nicking sgRNA 潜在脱靶位点进行 NGS 检测。

关键结果：

模型构建：成功在 HEK293T 细胞中安装 Viangchan 突变，获得纯合突变克隆;

效率优化：在 HEK293T 中，14 nt PBS+19 nt RTT 的 epegRNA 结合 + 64 bp 次级切口 sgRNA 时，纠正效率达 25.2%，indels 比例与对照组无显著差异;

iPSC 纠正：在 G6PD 缺陷 iPSC 中，纠正效率约 5%(GFP + 细胞中)，副产物(indels 和非预期碱基替换)水平与未转染对照组无显著差异;

特异性验证：预测的 5 个 epegRNA 和 5 个 nicking sgRNA 脱靶位点均未检测到超过基线的突变，证实无显著脱靶效应。

实验结果

图 1：HEK293T 细胞中 G6PD Viangchan 突变的安装

该图展示突变细胞模型的构建过程。(A)四引物 ARMS-PCR 检测显示，12/30 单克隆为杂合突变(含 151 bp 野生型和 292 bp 突变型条带);(B)Sanger 测序证实 exon9 的 c.871G>A 突变;(C)基因型频率分析显示，首轮转染获得 23.3% 单等位基因、16.7% 双等位基因突变，二次转染获得 21.4% 纯合突变。图示成功建立 Viangchan 突变模型。

图 2：HEK293T 细胞中 Viangchan 突变的纠正效率优化

该图呈现引导编辑参数优化结果。(A)epegRNA 和次级切口 sgRNA 的靶向设计，突变位点位于 exon9;(B)Sanger 测序轨迹显示纠正后的野生型序列;(C-F)量化分析表明，14 nt PBS+19 nt RTT 的 epegRNA 结合 + 64 bp 次级切口 sgRNA 时，纠正效率最高(25.2%)，indels 无显著增加，且 PE3 系统优于 PE5。

图 3：iPSC 中 Viangchan 突变的 PE3 介导纠正

该图验证 iPSC 中的纠正效果。(A)NGS 分析显示 GFP+ iPSC 中出现野生型序列(占 6.67%);(B)基线校正后，GFP + 细胞纠正效率约 5%，副产物频率与未转染组无差异。图示引导编辑可在 iPSC 中实现特异性纠正。

图 4：iPSC 中的脱靶效应分析

该图评估潜在脱靶位点突变。(A-B)NGS 显示，epegRNA 和 nicking sgRNA 的 5 个预测脱靶位点(E-OFF1-5、N-OFF1-5)突变频率与未转染组和对照组无显著差异。图示引导编辑无显著脱靶效应。

全文总结

本研究证实引导编辑可精准纠正 G6PD Viangchan 突变：在 HEK293T 细胞中优化后效率达 25.2%，iPSC 中约 5%，且 indels 和脱靶效应可忽略。核心价值在于：首次在 iPSC 中实现该突变的特异性纠正，为构建等基因细胞模型和开发自体细胞疗法(如造血干细胞编辑)提供工具;优化的 epegRNA 设计(14 nt PBS+19 nt RTT+64 bp 次级切口)为同类突变编辑提供参考。

局限性包括 iPSC 纠正效率较低(需改进递送方式如 RNP)、未验证 G6PD 酶活性恢复、依赖单一 iPSC 系。未来可结合 mRNA 递送提升效率，分化编辑后 iPSC 为红细胞验证功能，推动临床转化。