多组学驱动的基因组尺度代谢模型提高 HEK293 细胞的病毒载体产量

检测细胞株广泛应用于药物发现、抗体开发、基因研究和毒性评估等领域。基于D-Luciferase的报告基因细胞株及其荧光素酶检测方法在药物初筛/复筛、表位竞争、药物生物活性检测等多方面展现了广泛的应用潜力。报告基因法已被药典收录，为国家认可的检测方法。报告基因细胞株多用于监测特定的生物过程或信号通路。

HEK293细胞因子报告基因细胞株是以HEK293为工具细胞，采用慢病毒感染的方式构建，不仅能够稳定表达细胞因子受体蛋白，并且能够表达荧光素酶报告基因，是基于转录因子信号通路构建的荧光素酶报告基因细胞系。当细胞因子结合受体蛋白后，细胞因子与受体蛋白相互作用，激活转录因子信号通路，从而激活荧光素酶的表达。荧光信号的强弱即代表信号通路的激活效果，因此可用于相关药物的体外效果评价，筛选抗体以及筛选信号通路的激活剂或抑制剂。

基本信息

英文标题：In Silico–Designed TGFβRI/TGFβRII Receptor Complex Peptide Inhibitors Exhibit Biological Activity In Vitro

中文标题：计算机设计的 TGFβRI/TGFβRII 受体复合物肽抑制剂在体外具有生物活性

发表期刊：《Journal of Cellular and Molecular Medicine》

影响因子：4.2

作者单位：

1.Department of Internal Medicine, Asthma and Allergy, Medical University of Lodz, Lodz, Poland

2.Department of Pharmacology and Toxicology, Medical University of Lodz, Lodz, Poland

作者信息：

Jacek Plichta、Michał Karbownik、Piotr Kuna、Michał Panek(Jacek Plichta 为通讯作者)

研究背景

转化生长因子 β(TGF-β)是一类多效性细胞因子，参与调控细胞增殖、上皮间质转化(EMT)、成纤维细胞向肌成纤维细胞转化等多种生理过程，其信号通路过度激活与纤维化疾病、慢性炎症及肿瘤等多种人类疾病密切相关。目前已有小分子 TGF-β 抑制剂(如 SD-208、SB-525334)用于研究，但靶向 TGFβRI/TGFβRII 受体复合物的肽抑制剂研究较少，且尚无获批用于临床的 TGF-β 拮抗剂，因此研究人员通过计算机设计靶向该受体复合物的新型肽抑制剂(PIs)，旨在评估其体外生物活性和细胞毒性，为纤维化、肿瘤等疾病的治疗提供新的候选药物和研究方向。

研究方法

基于蛋白质数据库(PDB：3KFD)中 TGFβRI/TGFβRII/TGF-β 复合物的晶体结构，识别 TGF-β 与受体的关键结合界面，设计包含 9-12 个氨基酸的肽库，通过 HADDOCK 和 CABS-Dock 软件进行计算机对接筛选，合成候选肽抑制剂;以 SD-208、SB-525334 为阳性对照，利用稳定表达 CAGA12-Luc/Smad3/4 报告系统的 HEK293T 细胞系，通过荧光素酶发光实验评估肽抑制剂对 TGF-β 信号通路的抑制活性，并采用 4 参数逻辑回归计算 IC50 值;通过流式细胞术(Annexin V/PI 染色)检测肽抑制剂对 HEK293T 细胞的细胞毒性;采用双尾非配对 t 检验进行组间差异统计分析，以 p<0.05 为差异具有统计学意义。

实验结果

图1：TGF-β-SMAD 信号通路示意图

该图展示了 TGF-β 信号通路的激活过程：TGF-β 以无活性形式分泌，经整合素依赖方式激活后，结合细胞膜上的 TGFβRII 受体，招募并磷酸化 TGFβRI，激活的 TGFβRI 进一步磷酸化 SMAD2/3，后者与 SMAD4 形成异源三聚体，转运至细胞核调控靶基因表达。该示意图明确了肽抑制剂的作用靶点 ——TGFβRI/TGFβRII 受体复合物，为后续抑制剂的设计和活性评估提供了理论基础。

图2：TGFβ-TGFβRI/TGFβRII 复合物晶体结构及肽抑制剂设计的界面区域

图中红色标记了 5 个关键结合界面区域，对应的氨基酸序列分别为 ALDAAYCFRNVQD、CAGACPYLWSSDTQHSR 等，基于这些界面区域设计了一系列 9-12 个氨基酸的肽抑制剂。该图明确了肽抑制剂的设计依据，确保候选肽能够特异性结合受体复合物，阻断 TGF-β 配体与受体的相互作用。

图3：50μM 肽抑制剂处理后 HEK293T 细胞的发光值百分比

以无抑制剂的 TGF-β 处理组为阳性对照(100%)，未处理细胞为阴性对照，50μM 各肽抑制剂均能显著降低发光值(p<0.05)，平均抑制率达 80%;其中肽抑制剂 2_5、2_6、2_7 的抑制效果与 20μM SD-208 无显著差异(p 值分别为 0.706626、0.158059、0.536196)，证明这些肽抑制剂在高浓度下具有与阳性对照相当的体外抑制活性。

图4：20μM 肽抑制剂处理后 HEK293T 细胞的发光值百分比

与阳性对照相比，20μM 各肽抑制剂仍能显著降低发光值(p<0.05)，平均抑制率约 35%，表明肽抑制剂的抑制活性具有浓度依赖性，即使在较低浓度下也能有效抑制 TGF-β 信号通路激活，体现了其潜在的应用价值。

图5：肽抑制剂 1_5 的浓度 - 发光值曲线

横坐标为肽抑制剂 1_5 的浓度对数(μM)，纵坐标为相对发光单位(RLU)，通过 4 参数逻辑回归计算得出其 IC50 值为 24.21μM(95% 置信区间 20.17-29.01μM)。曲线显示随着肽抑制剂浓度升高，发光值逐渐降低，呈现明显的剂量依赖性抑制特征，验证了该肽抑制剂的生物活性。

图6：肽抑制剂 2_3 的浓度 - 发光值曲线

该曲线与肽抑制剂 1_5 类似，随着浓度升高，相对发光值显著下降，经 4 参数逻辑回归分析，其 IC50 值为 23.59μM(95% 置信区间 17.77-30.41μM)，进一步证明设计的肽抑制剂均具有剂量依赖性抑制 TGF-β 信号通路的活性，且部分肽抑制剂的 IC50 值较低，活性更优。

图7：20μM 各抑制剂处理后 HEK293T 细胞的活力

与未处理的对照组相比，20μM SD-208、SB-525334 及新型肽抑制剂(1_1、2_3)均未显著降低 HEK293T 细胞活力，细胞存活率均在 82% 以上。该结果表明所有测试的肽抑制剂均无明显细胞毒性，为其后续进一步开发提供了安全性基础。

研究结论

本研究通过计算机模拟设计并合成了靶向 TGFβRI/TGFβRII 受体复合物的新型肽抑制剂，基于 TGF-β-SMAD 信号通路的结构特征筛选关键结合界面，体外实验证实所有测试的肽抑制剂在 20μM 和 50μM 浓度下均能显著抑制 TGF-β 信号通路活性，其中 3 种肽抑制剂的抑制效果与阳性对照 SD-208 相当，IC50 值介于 20.81-57.19μM 之间，且所有肽抑制剂均无明显细胞毒性。这些结果表明计算机设计的肽抑制剂具有良好的体外生物活性和安全性，为纤维化、慢性炎症及肿瘤等 TGF-β 信号通路异常激活相关疾病的治疗提供了新的候选药物，后续将通过计算机进一步优化肽抑制剂结构，并在癌细胞系和 CD4+/CD8+ T 细胞中验证其免疫调节活性。