通过基于葫芦[7]脲的主客体识别重构肿瘤微环境以增强STING激活的癌症免疫疗法的超分子脂质纳米粒子

基本信息

英文标题：Supramolecular lipid nanoparticle reprograms tumor microenvironment by cucurbit[7]uril-based host–guest recognition for STING-activating cancer immunotherapy

中文标题：通过基于葫芦[7]脲的主客体识别重构肿瘤微环境以增强STING激活的癌症免疫疗法的超分子脂质纳米粒子

发表期刊：《Materials Today》

影响因子：22

作者单位：

清华大学化学系生物有机磷化学与化学生物学教育部重点实验室;浙江理工大学浙江省纤维材料与制备技术重点实验室;山西医科大学环境病原微生物与感染防控教育部重点实验室

作者信息：

Yunxuan Feng, Yuan Yu, Xinyang Yu, Mengyao Li, Jiaqi Lei, Yongcan Li, Zhida Liu, Shaolong Qi, Guocan Yu

研究背景

1.靶向cGAS-STING通路为癌症免疫治疗提供了新机遇，但其在治疗实体瘤(尤其是"冷肿瘤")中的临床疗效仍不理想。

2."冷肿瘤"的特征是T细胞浸润稀少、免疫原性低以及免疫抑制性的肿瘤微环境，这严重阻碍了细胞毒性T淋巴细胞(CTLs)的激活、增殖和浸润。

3.小分子STING激动剂在体内代谢快、清除迅速;同时，肿瘤内高浓度的内源性多胺会显著抑制cGAS活性，进一步削弱基于STING的免疫治疗效果。

4.研究创新点：本研究开发了一种名为MC7-LNP的超分子脂质纳米粒子系统。它基于葫芦[7]脲的主客体识别和金属配位作用，同时负载STING激动剂MSA-2和铜离子，旨在重构免疫抑制性TME，提高肿瘤免疫原性，并将"冷肿瘤"转变为"热肿瘤"。

研究方法

1.化学合成：

合成脂质修饰的葫芦[7]脲衍生物CB[7]-lipid(通过Huisgen环加成反应)。

合成树枝状可电离脂质G0-C14。

2.纳米粒子制备(MC7-LNP)：

使用微流控混合装置，将含有G0-C14、胆固醇、DSPC、ALC-0159、CB[7]-lipid和MSA-2的乙醇相，与含有mRNA和铜离子的水相(柠檬酸盐缓冲液)混合制备。

对所得混合物进行透析纯化。

3.表征分析：

使用核磁共振(¹H NMR， 2D NOESY)、质谱(MALDI-TOF， LCMS-IT/TOF)、等温滴定量热法(ITC)分析主客体相互作用及结合常数。

使用动态光散射(DLS)测定粒径和PDI，zeta电位仪测表面电位，透射电镜(TEM)观察形貌。

使用高效液相色谱(HPLC)测定载药量。

使用荧光共振能量转移(FRET)评估胶体稳定性。

4.体外实验：

使用共聚焦激光扫描显微镜(CLSM)和流式细胞术(FCM)研究细胞摄取、内体逃逸、ROS产生、细胞凋亡等。

使用蛋白质印迹(Western Blot)分析干扰素分泌、多胺生物合成和铜死亡相关蛋白表达。

使用酶联免疫吸附测定(ELISA)检测细胞因子(如IFN-α， IFN-β， cGAMP)水平。

5.体内动物实验：

建立C57BL/6小鼠B16黑色素瘤皮下移植瘤模型。

将荷瘤小鼠随机分组，瘤内注射不同制剂(PBS、CuSO₄、IL-12蛋白、MSA-2、LNP@CB[7]-lipid、LNP@MSA-2、MC7-LNP、MC7-LNP@mRNAIL-12)。

监测肿瘤体积、小鼠生存率。

通过FCM、免疫荧光、H&E染色分析肿瘤组织、引流淋巴结中的免疫细胞浸润(CD8⁺ T细胞、DC成熟度、M2巨噬细胞、Tregs等)及细胞因子水平。

使用电感耦合等离子体质谱(ICP-MS)评估铜在主要器官的蓄积。

实验结果

图1. MC7-LNP系统设计原理及作用机制示意图

a)MC7-LNP的化学成分和合成策略示意图。基于主客体识别和金属配位的驱动，通过微流控装置进行超分子自组装制备MC7-LNP。 b) MC7-LNP通过持续的STING刺激、多胺清除和缺氧缓解来重构免疫抑制性TME。当与mRNA结合时，这种协同策略极大地促进了CTL活化和免疫活性细胞因子的分泌，从而有效地将"冷肿瘤"转变为"热肿瘤"。

图2. 化学合成与主客体识别

a) CB[7]-lipid的合成路线。 b) MSA-2和CB[7]之间主客体结合的分子动力学模拟。 c) MSA-2和CB[7]形成的主客体复合物的化学结构。 d) CB[7]、MSA-2 + CB[7]、MSA-2的¹H NMR谱图。e) MSA-2和CB[7]的2D NOESY谱图。 f) ¹H NMR滴定谱图。 g) 模拟过程的RMSD变化。h) 分子动力学模拟期间的SASA变化。 i) 随着MSA-2与CB[7]摩尔比的增加，CB[7]上质子H₂的化学位移变化。 j) 通过¹H NMR滴定确定MSA-2和CB[7]之间Ka值的非线性拟合图。

图3. MC7-LNP的制备与表征

a) DLS测定的MC7-LNP粒径分布图。b) DLS测定的MC7-LNP@mRNALuci粒径分布图。 c) MC7-LNP和MC7-LNP@mRNALuci的平均粒径。 d) MC7-LNP和MC7-LNP@mRNALuci的PDI值。 e) MC7-LNP和MC7-LNP@mRNALuci的Zeta电位。 f) MC7-LNP和MC7-LNP@mRNALuci的TEM图像。比例尺 = 100 nm。 g) MC7-LNP和MC7-LNP@mRNALuci在PBS缓冲液中4°C下储存时的粒径变化。 h) 有无多胺存在时，MSA-2在不同时间点的累积释放曲线。 i) 有无多胺存在时，铜离子在不同时间点的累积释放曲线。 j) 图3q中生物发光信号的定量分析。 k) FITC和RhB标记的LNP用于FRET检测的简图。 l) FITC和RhB标记的MC7-LNP在PBS中的归一化荧光强度。 m) FITC和RhB标记的MC7-LNP@mRNALuci在DMEM培养基中的归一化荧光强度。 n) 图3s中主要器官生物发光信号的定量分析。 o) 用含有不同浓度铜离子的MC7-LNP@mRNAGFP处理后B16细胞的CLSM图像。比例尺 = 100 μm。 p) B16细胞与DiR标记的MC7-LNP在不同时间点孵育后的CLSM图像。比例尺 = 10 μm。 q) 注射后36小时主要器官的离体生物发光图像。 r) 注射后36小时主要器官的离体荧光图像。 s) 瘤内注射DiR标记的MC7-LNP@mRNALuci后小鼠的体内生物发光图像。 t) 瘤内注射DiR标记的MC7-LNP@mRNALuci后小鼠的体内荧光图像。 缩写：T，肿瘤;H，心脏;Li，肝脏;S，脾脏;Lu，肺;K，肾脏。

图4. MC7-LNP对免疫抑制性TME的重构

a) TME重构和实验分析的示意图。 b) 不同处理24小时后细胞内IFN-α的浓度。 c) 不同处理24小时后细胞内IFN-β的浓度。 d) 不同处理24小时后细胞内Spm含量的测定。 e) DCF荧光的CLSM图像。 f) Z-DNA荧光的CLSM图像。 g) 检测氧化性DNA损伤的8-OHdG荧光CLSM图像。 h) 研究应激反应的CRT荧光CLSM图像。 i) 不同处理24小时后细胞内Spd含量的测定。 j) B16细胞与不同制剂孵育24小时后的细胞内cGAMP浓度。 k) 不同处理后，通过FCM分析的DCF⁺ B16细胞百分比。 l) 不同处理后细胞内HIF-1α的浓度。 m) 不同处理后上清液中ATP的浓度。 所有比例尺 = 20 μm。

图5. TME重构后的T细胞活力恢复

a) 用于研究CTL活化的CTLs分选及体外共培养的系统方案。 b) CFSE标记的CTLs的代表性荧光直方图。 c) 图5b中CFSE-A的平均荧光强度。 d) B16细胞与CTLs共培养24小时后的CLSM图像。比例尺 = 20 μm。 e) 不同制剂处理的B16细胞的TEM图像。每组第一张图显示细胞全貌，后续图像为放大视图。比例尺 = 2 μm。 f) 图5g中凋亡B16细胞的统计计数。 g) 用于确定细胞凋亡的B16细胞FCM等高线图。 h) 涉及干扰素分泌、多胺生物合成和铜死亡的超分子调控机制。 i-k) 参与各通路的不同蛋白质的Western Blot分析：干扰素分泌(i)、多胺生物合成(j)、铜死亡(k)。

图6. 黑色素瘤模型中CTLs应答研究

a) B16皮下肿瘤模型的简要描述。 b) 不同处理后小鼠的肿瘤体积变化。 c) 不同处理后小鼠的生存率曲线。 d) TDLNs的FCM分析以评估DC成熟度。 e) 瘤内CD3⁺CD8⁺ T细胞的百分比。 f) 瘤内CTLs的FCM分析以确定T细胞类型。 g) CD8⁺Ki67⁺ T细胞的百分比。 h) CD8⁺Tim3⁺ T细胞的百分比。 i) 肿瘤组织中细胞因子的浓度。 j) 肿瘤组织的免疫荧光染色以研究T细胞活化。比例尺 = 100 μm。 k) 瘤内M2巨噬细胞的比例。 l) 瘤内调节性T细胞的比例。 m) TDLNs中记忆T细胞的比例。

研究结论

1.成功构建多功能超分子纳米平台： 开发了基于CB[7]主客体识别和金属配位的MC7-LNP系统，实现了MSA-2和铜离子的高效共负载与控释。

2.有效重构免疫抑制性TME：

清除多胺： CB[7]可高效结合并清除肿瘤内的免疫抑制性多胺(精胺、亚精胺)，解除其对cGAS-STING通路的抑制。

缓解缺氧/诱导氧化应激： 铜离子催化产生活性氧，缓解肿瘤缺氧，同时诱导DNA损伤和损伤相关分子模式(DAMPs)释放，显著提升肿瘤细胞免疫原性。

持续激活STING通路： 主客体复合物实现了MSA-2的缓释，延长了STING通路的激活时间。

3.协同增强抗肿瘤免疫：

当与编码IL-12的mRNA联用时(MC7-LNP@mRNAIL-12)，该系统在体外和体内均能强烈激活CTLs，促进其增殖、细胞因子分泌(如IFN-γ, GZM-B)，并减少耗竭标志物(Tim3)表达。

显著促进树突状细胞成熟，降低M2巨噬细胞和调节性T细胞比例，逆转免疫抑制微环境。

显著抑制肿瘤生长： 在B16黑色素瘤模型中，MC7-LNP@mRNAIL-12治疗能最有效地抑制肿瘤生长，延长小鼠生存期，并诱导免疫记忆形成。

4.展示良好生物安全性： 瘤内给药未引起主要器官的明显病理损伤或异常铜蓄积。

文献意义:

本研究创新性地将超分子主客体化学与脂质纳米粒技术相结合，为解决STING激动剂在实体瘤治疗中的瓶颈(如快速代谢、免疫抑制微环境)提供了一个多功能的协同治疗平台。它不仅显著增强了STING通路的激活效率和持久性，还通过主动重塑TME，将"冷肿瘤"转化为"热肿瘤"，为基于STING的癌症免疫疗法的发展提供了新的思路和强有力的实验依据。