突破 “不可成药” 靶点！新型分子胶降解剂精准狙击 c-Myc 癌蛋白

在生物医学研究和药物开发领域，生物发光成像技术因其高信噪比而被广泛应用于细胞测定和动物成像研究。然而，传统的荧光素酶种类有限，限制了同时成像多个分子和细胞事件的能力。为了突破这一限制，科学家们开发了一种新型的ATP非依赖性荧光素酶——NanoLuc(NL)，它源自深海虾Oplophorus gracilirostris，并经过工程改造以增强蛋白质稳定性。NanoLuc作为一种小型(19 kDa)、高亮度的荧光素酶，其亮度是传统萤火虫或海肾荧光素酶的100倍，并且使用furimazine作为底物产生明亮的辉光型发光。NanoLuc的意义在于其为双报告基因生物发光分子成像提供了新的可能。它不仅可以在活体小鼠的表层和深层组织中成像，而且其生物发光随时间的变化可以用来定量肿瘤生长，甚至在少量血清中也能检测到分泌的NL。此外，NanoLuc与萤火虫荧光素酶的结合使用，为在完整细胞和活体小鼠中定量TGF-β信号传导的两个关键步骤提供了一种新型双荧光素酶成像策略，从而在正常生理、疾病和药物开发中扩展了信号转导的成像能力。NanoLuc的作用不仅体现在其高灵敏度和高稳定性上，它还具有更小的尺寸，这使得在标记细胞和蛋白质时对样本的侵入性更小，有助于保持细胞或组织的天然状态。NanoLuc的快速反应、低背景发光和多样灵活等特点，使其在生物学和医学研究中具有广泛的应用前景。因此，NanoLuc作为一种新的报告基因，不仅增强了我们对生物过程的理解和疾病机理的研究，而且在开发潜在治疗方法和疗法方面发挥了重要作用。

基本信息

英文标题：Cell-based high-throughput screening using a target–NanoLuc fusion construct to identify molecular glue degraders of c-Myc oncoprotein

中文标题：基于靶标 - NanoLuc 融合构建体的细胞水平高通量筛选鉴定 c-Myc 癌蛋白的分子胶降解剂

发表期刊：《RSC Chemical Biology》

影响因子：3.1

作者单位：

1.Centre of Translational Research, Shenzhen Bay Laboratory, Guangming District, Shenzhen, Guangdong 518132, China. E-mail: wshen@cpl.ac.cn, jeffrey.hill@beigene.com, xumy@szbl.ac.cn

2.University of Chinese Academy of Sciences, 19 Yuquan Rd, Shijingshan District, Beijing, 100049, China

3.Multi-omics Mass Spectrometry Core, Biomedical Research Core Facilities, Shenzhen Bay Laboratory, Guangming District, Shenzhen, Guangdong, 518132, China

作者信息：

Muyu Xu*、Jinying Qiu、Lin Tan、Jiayu Xu、Yi Wang

研究背景

c-Myc 癌蛋白作为 DNA 结合转录因子，调控约 15%-20% 的细胞基因表达，参与细胞增殖、周期调控等多种关键生理过程，其异常表达与超过 70% 的癌症发生发展密切相关。然而，由于 c-Myc 结构灵活、无传统配体结合口袋且定位于细胞核内，长期被视为 “不可成药” 靶点，至今尚无直接靶向 c-Myc 的获批药物。靶向蛋白降解技术(如 PROTACs、分子胶降解剂)为 “不可成药” 靶点提供了新策略，其中分子胶降解剂具有分子量小、易跨膜、可口服等优势，更适合靶向柔性转录因子 c-Myc。但分子胶降解剂的发现多依赖偶然因素，缺乏高效的高通量筛选方法，因此研究人员开发了基于 Myc-NanoLuc 融合质粒的细胞水平高通量筛选系统，旨在快速鉴定能下调 c-Myc 的小分子分子胶降解剂。

研究方法

构建 f-Myc-Nluc 融合质粒和 f-Nluc 空载质粒，分别瞬时转染 293T 细胞，建立基于生物发光的高通量筛选(HTS)体系，以已知 Myc 下调化合物 UNC10112785 为阳性对照，先从 17452 种生物活性化合物库中验证筛选体系有效性，再对 108800 种 ChemDiv 化合物库进行筛选;通过三轮挑选验证、反向筛选(排除荧光素酶抑制剂和细胞毒性化合物)、剂量反应实验和 Western blot 验证，获得候选 Myc 下调化合物;采用细胞热迁移实验(CETSA)检测候选化合物与内源性 Myc 的结合能力;通过无标记定量质谱分析化合物的靶向特异性;利用 Western blot 测定化合物对 Myc 的降解效率(DC50);通过细胞活力实验(CTG)评估化合物对高 / 低 Myc 表达癌细胞的选择性杀伤作用;借助实时定量 PCR 检测化合物对 Myc 靶基因表达的影响;通过免疫共沉淀(Co-IP)和荧光显微镜成像探究化合物的作用机制。

实验结果

图 1：14 种新型 Myc 下调小分子的筛选鉴定图

(A)展示了 f-Myc-Nluc 和 f-Nluc 质粒构建及筛选流程，通过生物活性化合物库筛选出已知 Myc 下调化合物 G9(去泛素化酶抑制剂)和 SY-1365(CDK7/9 抑制剂)，验证了筛选体系的有效性;(B)显示阳性对照 UNC10112785 在转染细胞中的剂量 - 发光值曲线;(C)Western blot 结果证实 25 个候选化合物中 14 个能有效降解异位表达的 f-Myc-Nluc 和内源性 Myc;(D)呈现 14 种化合物的化学结构及分子量，其中 C3、C13、C14 含 PAINS 警报。该结果表明构建的高通量筛选体系能高效筛选出 Myc 下调小分子。

图 2：CETSA 分析化合物与 Myc 的结合能力图

以已知 Myc 结合抑制剂 MYC361i 为阳性对照，在 56℃加热条件下，对 14 种候选化合物进行剂量梯度(0.01μM-100μM)CETSA 检测。结果显示，C1、C3、C7、C8、C11 能剂量依赖性提高 293T 细胞裂解液中可溶性 Myc 的含量，即增强 Myc 的热稳定性，表明这 5 种化合物能直接结合内源性 Myc 蛋白，具备成为分子胶降解剂的潜力。

图 3：化合物 C1 的降解活性及特异性验证图

(A)NanoGlo 实验显示 C1 对 f-Myc-Nluc 的 DC50 约为 9.1μM，且不抑制 f-Nluc 活性;(B)Western blot 证实 C1 对 Myc 的 DC50 约为 5μM，对 GAPDH、BRD4 等其他蛋白无明显降解作用;(C)时间依赖性实验表明 C1 处理 Ramos 细胞 2 小时后开始降解 Myc 和其相互作用蛋白 Max;(D)对比显示 C7、C8 虽与 C1 具有相近的 Myc DC50，但对其他蛋白的非特异性降解更显著。该结果证明 C1 能特异性降解 Myc/Max 复合物。

图 4：C1 对高 Myc 表达癌细胞的选择性杀伤及靶基因调控图

(A)结合 The Human Protein Atlas 数据库的 Myc mRNA 表达水平(nTPM)与 CTG 实验结果，显示 C1 的 GI50 与细胞 Myc 表达水平呈负相关;(B)剂量 - 细胞活力曲线表明 C1 对高 Myc 表达的 Ramos 细胞杀伤作用最强(GI50≈7.6μM);(C)数据显示 C1 对 Ramos 细胞的选择性是低 Myc 表达细胞的 5.2 倍以上;(D)实时定量 PCR 证实 C1 能选择性下调 CAD、CCNB1 等 Myc 靶基因表达，对非 Myc 靶基因 ACTB 无明显影响。

图 5：C1 的分子作用机制图

(A)Co-IP 实验显示，随着 C1 浓度升高，f-Myc pull-down 的内源性 Myc 增多，而结合的 Max 减少，FBXW7 等 E3 连接酶结合无明显变化;(B)定量分析证实 Myc 聚集与 Max/Myc 结合比例呈负相关;(C)Western blot 显示蛋白酶体抑制剂 MG132 可阻断 C1 介导的 Myc 降解;(D)机制示意图表明 C1 作为分子胶诱导 Myc 自我聚集，阻断 Myc/Max 相互作用，进而促进 Myc/Max 通过蛋白酶体或自噬途径降解。

研究结论

本研究成功开发了基于 Myc-NanoLuc 融合质粒的细胞水平高通量筛选体系，通过筛选 12 万余种化合物，获得 14 种新型 Myc 下调小分子，其中 5 种能直接结合 Myc。深入表征显示化合物 C1 具有分子胶特性，能以约 5μM 的 DC50 特异性降解 Myc/Max 复合物，且对高 Myc 表达癌细胞具有选择性杀伤作用(选择性达 5.2 倍以上)，并能特异性下调 Myc 靶基因表达。机制研究表明 C1 通过诱导 Myc 自我聚集、阻断 Myc/Max 相互作用，促进靶蛋白降解。该筛选体系为 Myc 靶向分子胶降解剂的发现提供了高效工具，而 C1 作为新型 Myc 分子胶降解剂，为 “不可成药” 靶点 c-Myc 相关癌症的治疗提供了新的候选药物和研究方向。