鱿鱼（Euprymna berryi）原代细胞的分离、培养与转染实验方案

头足类(章鱼、鱿鱼、乌贼)是行为最复杂的无脊椎动物，具备高度发达的感觉和神经系统、相机型眼睛，还能通过色素细胞快速变色、进行 A-to-I RNA 编辑，在神经科学和分子生物学领域贡献显著(如鱿鱼巨轴突揭示神经电信号传递、从巨轴突中分离驱动蛋白)。但长期以来，缺乏针对海洋无脊椎动物的常规分子生物学工具(如稳定细胞培养体系、外源基因表达技术)，成为解析其独特生物学机制的主要障碍。Euprymna berryi(蜂鸟短尾鱿鱼)作为新兴模式生物，具有体型小(约 2 英寸)、性成熟快、寿命短(6-8 个月)、耐受拥挤且可实验室繁殖等优势，尤其雌性产卵后不会像章鱼那样衰老死亡，适合衰老研究;然而，其原代细胞的分离、培养及转染体系尚未建立，限制了对其细胞水平机制(如 RNA 编辑、变色调控)的研究，因此亟需开发一套针对该物种不同组织和年龄的原代细胞实验方案。

本研究提出一套针对 Euprymna berryi(蜂鸟短尾鱿鱼)不同组织(眼睛、视叶、鳃)和年龄(胚胎至成体)原代细胞的分离、培养及转染实验方案，具体包括鱿鱼解剖、组织解离与细胞分离、细胞培养维持(优化渗透压至～950 mOsm/kg、添加 FGF/EGF/ITS-G 的培养基)以及外源 mRNA 转染步骤。同时，强调 E. berryi 的生命周期可控性(6-8 个月)及衰老特征(如眼睛浑浊、色素细胞变化)，使其适合未来衰老研究。该方案成功实现鱿鱼原代细胞的贴壁培养(维持 3-5 天)及 mRNA 转染(如 NPM1-RFP、FIB1-eGFP)，可推动对鱿鱼特有生物学过程(复杂行为、快速变色、RNA 编辑)的细胞和分子水平研究，同时为基础细胞生理学及海洋无脊椎动物研究提供新工具。

实验方法

鱿鱼解剖与组织消毒：将鱿鱼用 5% 乙醇安乐死后，固定于 Sylgard 解剖盘，用无菌工具分离眼睛、视叶、鳃等目标组织;将组织放入含青霉素 - 链霉素的消毒平衡盐溶液(DBSS)中，21-25℃消毒 30 分钟(每 5-10 分钟摇晃一次)，移除 DBSS 备用。

组织解离与细胞分离：将消毒后的组织转移至含胰蛋白酶 - EDTA 溶液 A(无钙镁平衡盐溶液配制)的 24 孔板(500μL / 视叶 / 鳃，1mL / 眼睛)，室温孵育 10 分钟;加入 2mL 鱿鱼生长培养基 B 中和胰蛋白酶，孵育 15 分钟后，将组织转移至含培养基 C 的新孔板孵育 1 小时，再转移至含 FGF(10ng/mL)、EGF(100ng/mL)及 ITS-G 的培养基 D 中过夜，收集解离的细胞。

细胞培养与传代：将分离的细胞接种于 24 孔玻璃底培养板，21-25℃培养，每日更换培养基 D;细胞 1-2 小时内贴壁，维持 3-5 天;如需传代，用无菌细胞刮(或胰蛋白酶 - EDTA 溶液 B)收集细胞，转移至新孔板，待细胞重新贴壁后更换培养基 D。

mRNA 转染与成像：当细胞融合度达 70%-90% 时，用 Opti-MEM 配制 mRNA - 脂质体复合物(Lipofectamine MessengerMAX);移除旧培养基，加入不含青霉素 - 链霉素的培养基 C，再加入复合物，21-25℃孵育 24 小时;通过活细胞成像(Hoechst 染核，1:50000 稀释，孵育 1 小时)或固定后免疫荧光观察外源基因表达。

细胞固定：移除培养基，用软体动物平衡盐溶液(MBSS)洗涤细胞两次;加入 4% 多聚甲醛(MBSS 配制)，室温固定 10-15 分钟;用 MBSS 洗涤三次，可立即用于染色或 4℃保存。

关键结果

图1：E. berryi 的生命周期与衰老特征

展示 E. berryi 的四个生命周期阶段(胚胎、幼体、幼年期、成体)，标注各阶段尺寸(胚胎 / 幼体 1mm、幼年期 1cm、成体 1cm)及平均寿命(6-8 个月);同时呈现 7 月龄雄性鱿鱼的衰老表型 —— 伸展的色素细胞(图 1B)和眼睛白内障样浑浊(图 1C，黄色箭头)。结果证实 E. berryi 的生命周期可控且具有明确衰老特征，为后续基于原代细胞的衰老研究提供理想模型。

图2：不同组织和年龄的鱿鱼原代细胞分离情况

为 2 周龄幼体鱿鱼(比例尺 1mm);图 2B 为从眼睛、鳃、视叶分离细胞的流程;图 2C 为幼体鱿鱼鳃(黄色箭头)、眼睛和视叶(粉色框，黄色箭头)的特写(比例尺 1mm);图 2D 为鳃组织迁移出的细胞(比例尺 100μm);图 2E 为眼睛来源细胞的 DIC 图像(比例尺 10μm);图 2F 为视叶细胞固定后鬼笔环肽(绿色，肌动蛋白)和 DAPI(蓝色，细胞核)染色结果(比例尺 10μm);图 2G 对比 1 月龄、3 月龄、6.5 月龄鱿鱼视叶细胞(白色比例尺 1cm，黑色比例尺 50μm)。结果表明，该方案可从不同年龄(2 周至 6.5 月龄)和组织成功分离原代细胞，细胞呈 fibroblast-like 形态且能贴壁生长。

图3：鱿鱼解剖操作细节

展示成年雄性鱿鱼固定方式(黄色星号为昆虫针固定位置，白色虚线为外套膜切口);图 3B 显示分离眼睛(橙色箭头)和视叶(绿色箭头)时需同步移除结缔组织(黄色箭头);图 3C 为打开外套膜后鳃的位置(黑色虚线标记)，所有比例尺均为 1cm。该图明确解剖关键步骤和目标组织位置，确保实验者准确获取高纯度组织，提升后续细胞分离成功率。

图4：鱿鱼细胞培养条件优化与传代能力

展示视叶细胞从 P1(第一代)传代至 P2(第二代)的情况，细胞可重新贴附(插图为局部特写，比例尺 50μm)，虽细胞数量减少但证实传代潜力;图 4B 对比培养基条件：在 FGF+EGF 基础上添加 ITS-G 可显著改善细胞贴壁效果(插图为各条件细胞特写，比例尺 50μm)。结果表明优化的培养基(含 FGF、EGF、ITS-G)能提升细胞存活和贴壁效率，为长期培养奠定基础。

图5：鱿鱼原代细胞的 fibroblast-like 形态特征

为视叶细胞活细胞染色，Hoechst(蓝色)标记细胞核，SPY650 - 微管蛋白(绿色)标记微管，黄色箭头指示细胞核旁未知胞质体(插图为单个细胞特写，比例尺 10μm);图 5B 为 Hoechst 标记的细胞核全景图，显示细胞核形态异质性(比例尺 50μm)。结果证实分离的原代细胞具有典型 fibroblast-like 特征：形态伸长、扁平细胞核、清晰微管结构，同时发现独特胞质体结构，为细胞类型鉴定提供参考。

图6：细胞从组织外植体的迁移过程

展示视叶组织外植体贴附后，细胞在 62 分钟内从外植体爬出的动态过程(比例尺 50μm);图 6B 显示外植体携带微生物和碎片，而爬出的细胞可形成单层(比例尺 50μm)。结果表明组织外植体是细胞分离的有效来源，且悬浮培养外植体可减少污染，延长细胞体外存活时间。

图7：鱿鱼原代细胞的 mRNA 转染效率

图 7A 为转染前视叶细胞核(Hoechst 染色，比例尺 10μm);图 7B-D 分别为转染非洲爪蟾序列的 NPM1-RFP、FIB1-eGFP、Kaede NLS-GFP 24 小时后的表达情况，外源蛋白均定位于细胞核，且 NPM1/FIB1 形成 1-2 个外周亮斑(比例尺 5μm);图 7E 统计转染效率：NPM1-RFP 为 5.17%(329 个核)、FIB1-eGFP 为 3.70%(379 个核)、Kaede NLS-GFP 为 1.21%(1070 个核)。结果证实该方案可成功实现 mRNA 转染，为外源基因功能研究提供可能。

研究结论

本研究成功建立了 Euprymna berryi 不同组织(眼睛、视叶、鳃)和年龄原代细胞的分离、培养及 mRNA 转染实验方案：通过优化培养基(调整渗透压、添加生长因子)，使细胞呈 fibroblast-like 贴壁生长并维持 3-5 天，且可进行有限传代;利用 Lipofectamine MessengerMAX 实现外源 mRNA 转染，外源蛋白能正确定位至细胞核，虽转染效率较低(1.21%-5.17%)且无法实现 DNA 质粒转染(可能因启动子不兼容或细胞增殖率低)，但仍填补了鱿鱼细胞生物学工具的空白。同时，E. berryi 的生命周期和衰老特征使其适合衰老研究，该方案可推动对鱿鱼特有生物学过程(RNA 编辑、快速变色)的细胞水平解析，未来结合单细胞 RNA 测序可进一步鉴定细胞类型，优化 DNA 转染方法(如显微注射)，并减少实验用活体鱿鱼数量，为头足类及海洋无脊椎动物研究提供新范式。