OBM1701 通过抑制视网膜色素上皮细胞 HIF-1α 减轻实验动物脉络膜新生血管

新生血管性年龄相关性黄斑变性(nAMD)以脉络膜新生血管(CNV)为核心病理特征，是老年人群失明的主要原因，现有抗 VEGF 药物需玻璃体内注射，易引发视网膜纤维化、感染性眼内炎等并发症，且部分患者出现耐药。中国台湾 Mackay 纪念医院团队在《Translational Vision Science & Technology》上发表题为OBM1701 Alleviates Choroidal Neovascularization in Experimental Animals Via Suppressing the Expression of HIF-1α in Retinal Pigment Epithelial Cells的研究：OBM1701 是色素上皮衍生因子(PEDF)的 7 肽片段(Asp64-Ser70)，此前已证实可抑制角膜新生血管;本研究通过大鼠和小鼠激光诱导 CNV 模型，发现局部使用 OBM1701 滴眼液可显著减少 CNV 渗漏和面积，机制为抑制视网膜色素上皮(RPE)细胞中缺氧诱导的 HIF-1α 及下游 VEGF 表达，为 nAMD 提供非侵入性治疗新候选药物。

实验背景

nAMD 的核心病理改变是 CNV 突破 RPE 和 Bruch 膜进入视网膜下，导致黄斑水肿和出血;现有抗 VEGF 药物需反复注射且存在并发症，PEDF 是内源性抗血管生成因子，其衍生肽具治疗潜力，但最短功能片段 OBM1701 对 CNV 的作用及机制尚未明确。

实验方法

构建大鼠(8 个激光损伤点)和小鼠(3 个激光损伤点)激光诱导 CNV 模型，激光损伤 2 天后每日局部给予 OBM1701 滴眼液(1mM，含 1.5% DMSO)，持续 12 天;通过荧光素血管造影(FFA)分级评估 CNV 渗漏，isolectin GS-IB4 染色测 CNV 面积;体外用 DMOG(缺氧模拟剂)处理 ARPE-19 细胞、1% 氧处理原代猪 RPE 细胞，qPCR 和 Western blot 检测 HIF-1α/VEGF 的基因和蛋白表达，免疫荧光定位相关蛋白。

实验结果

OBM1701 使大鼠 CNV 显著渗漏(2a+2b 级)比例从 59.6% 降至 20.8%，小鼠从 75% 降至 46%，CNV 面积较对照减少 40% 以上;体外可抑制缺氧诱导的 ARPE-19 和原代猪 RPE 细胞中 HIF-1α/VEGF 表达(蛋白水平降低 2-3 倍);免疫荧光显示 OBM1701 可减少 CNV 病灶中 RPE 细胞的 HIF-1α 和 VEGF 积累。

实验方法

动物模型与给药：雄性 Brown Norway 大鼠(200-250g)和雌性 C57BL/6 小鼠(6-8 周龄)，麻醉后用 532nm Nd:YAG 激光制作 CNV 模型(大鼠：800mW、0.1s、60μm;小鼠：600mW、0.1s、75μm)，激光产生气泡确认 Bruch 膜损伤;激光后 2 天开始给药，OBM1701 滴眼液(1mM，含 1.5% DMSO)每日 1 次，每次 15μL(大鼠)或 5μL(小鼠)，连续 12 天，对照为 DMSO 溶剂或对照肽(Cont P)。

CNV 评估：激光后 14 天行 FFA，大鼠尾静脉注射 2.5% 荧光素(0.2mL)，小鼠腹腔注射(0.1mL)，记录 1、3、7 分钟图像，渗漏分级：0 级(弱荧光)、1 级(可疑渗漏)、2a 级(强度增加)、2b 级(强度和面积均增加);FFA 后 2 天取眼制作 RPE / 脉络膜铺片，isolectin GS-IB4 染色，ImageJ 测 CNV 面积。

细胞培养与缺氧处理：ARPE-19 细胞用含 10% FBS 的 DMEM-F12 培养，原代猪 RPE 细胞从新鲜猪眼分离(6-8 月龄)，用 10% FBS 的高糖 DMEM 培养;缺氧处理：ARPE-19 加 1mM DMOG，原代猪 RPE 置于 1% O₂培养箱，OBM1701 预处理 5 小时(20μM)。

分子检测：qPCR 检测 HIF1A 和 VEGFA mRNA(内参为 ACTB)，引物序列：人 VEGFA( sense: 5'-CTTCTGAGTTGCCCAGGAGA-3'，antisense: 5'-CTGTCATGGGCTGCTTCTTC-3');Western blot 检测 HIF-1α(~120kDa)和 VEGF(~16-24kDa)，内参为 β-actin;免疫荧光用 HIF-1α(GTX127309)、VEGF(GTX21316)和 RPE 标志物 RPE65(GTX13826)抗体，Hoechst 染核。

药物分布定量：FITC 标记 OBM1701，局部给药后 1、3、6 小时取视网膜，RIPA 裂解后测荧光强度(激发 495nm / 发射 520nm)，用标准曲线计算视网膜中药物含量。

统计分析：用 GraphPad Prism，计量资料以 “均值 ±SEM” 表示，两组比较用 t 检验，多组用 ANOVA+Dunnett 校正，p<0.05 为显著。

关键结果

图1：OBM1701 减轻大鼠激光诱导 CNV 的血管渗漏

激光后 14 天 FFA 显示，对照组大鼠 59.6% 的 CNV 病灶表现为 2a+2b 级显著渗漏(强度和面积增加)，而 OBM1701 处理组仅 20.8%(p<0.05);红外图像定位激光损伤点，FFA 早期(1 分钟)和晚期(7 分钟)对比显示，OBM1701 组渗漏区域的荧光强度和范围均显著小于对照组，且 0 级和 1 级渗漏比例升高，证实其减少 CNV 血管渗漏的作用。

图2：OBM1701 减轻小鼠激光诱导 CNV 的渗漏与面积

小鼠模型中，对照组 75% 的 CNV 病灶为显著渗漏(2a+2b 级)，OBM1701 组降至 46%(p<0.05)，且 2b 级(面积增加)病灶比例从 50% 降至 17%(p<0.01);RPE / 脉络膜铺片 isolectin GS-IB4 染色显示，OBM1701 组 CNV 面积(1.6±0.23×10⁴μm²)较对照组减少 40% 以上(p<0.002)，而对照肽(Cont P)处理组 CNV 渗漏和面积与对照组无差异，说明 OBM1701 的作用具特异性。

图3：局部应用 OBM1701 可进入大鼠视网膜并富集于 RPE

FITC 标记的 OBM1701 局部给药 1 小时后，视网膜冷冻切片显示荧光信号主要分布于光感受器外段和 RPE 层，含 DMSO 的滴眼液使 RPE 层荧光富集更显著，而对照肽(Cont P)无 RPE 富集;定量显示 1 小时时，OBM1701/DMSO 组 15.4% 的药物进入视网膜，OBM1701/BSS 组为 8.7%，6 小时后均降至 4% 以下，证实 OBM1701 可通过局部给药穿透眼表屏障，进入视网膜并在 RPE 停留。

图4：OBM1701 抑制 DMOG 诱导的 ARPE-19 细胞 HIF-1α/VEGF 表达

DMOG 处理 ARPE-19 细胞后，HIF-1α 和 VEGF 蛋白水平较正常组升高 4.8 倍和 3.7 倍(p<0.01)，mRNA 水平升高 1.4 倍和 2.7 倍(p<0.03);OBM1701 预处理可使上述指标降至接近正常水平，免疫荧光显示 DMOG 诱导的 HIF-1α 核定位和 VEGF 胞质积累在 OBM1701 处理后显著减弱，对照肽无此效果，证实 OBM1701 在人 RPE 细胞中抑制缺氧诱导的 HIF-1α/VEGF 通路。

图5：OBM1701 抑制缺氧诱导的原代猪 RPE 细胞 HIF-1α/VEGF 表达

原代猪 RPE 细胞培养 14 天后呈铺路石样形态，表达 RPE 标志物 RPE65 和紧密连接蛋白 ZO-1;1% 氧缺氧处理后，HIF-1α 和 VEGF 蛋白水平升高 5.9 倍和 5.4 倍(p<0.001)，OBM1701 预处理使两者升高幅度降至 1.6 倍和 2.7 倍;免疫荧光显示缺氧诱导的 HIF-1α 核荧光和 VEGF 胞质荧光在 OBM1701 处理后明显减弱，进一步在原代 RPE 细胞中验证了 OBM1701 的作用。

图6：OBM1701 减少小鼠 CNV 病灶中 RPE 细胞的 HIF-1α/VEGF 积累

激光后 7 天小鼠 RPE / 脉络膜切片免疫荧光显示，对照组 CNV 病灶中 RPE 细胞(RPE65 阳性)的 HIF-1α 核信号和 VEGF 胞质信号显著增强，而 OBM1701 处理组信号强度接近正常视网膜水平;无 CNV 病灶的视网膜区域中，各组 HIF-1α/VEGF 信号均较弱，说明 OBM1701 可特异性抑制 CNV 病灶处 RPE 细胞的 HIF-1α/VEGF 表达。

研究结论

本研究证实 PEDF 衍生 7 肽 OBM1701 通过局部滴眼液给药，可有效减轻大鼠和小鼠激光诱导的 CNV 渗漏与面积，其机制为靶向 CNV 病灶中的 RPE 细胞，抑制缺氧诱导的 HIF-1α 表达及下游 VEGF 合成，且在人 ARPE-19 细胞和原代猪 RPE 细胞中均能重现此抑制效应;OBM1701 作为非侵入性治疗候选药物，克服了现有抗 VEGF 药物需注射的缺陷，但其滴眼液中 DMSO 虽增强药物递送却存在视网膜毒性，未来需优化制剂配方，同时需在兔等更接近人类眼部结构的模型中验证长期疗效，以推进其在 nAMD 临床治疗中的转化应用。