告别 “短命” 荧光素酶！纳米花固定化技术解锁稳定生物发光检测

荧光素酶报告基因系统是一种基于荧光素酶催化底物氧化反应产生生物发光的检测技术，广泛应用于细胞生物学研究。其中，萤火虫荧光素酶(firefly luciferase, Fluc)因其高灵敏度、宽线性检测范围(约7~8个数量级)以及较短的半衰期(在哺乳动物细胞中约为3小时，在植物细胞中约为3.5小时)而成为最常用的报告基因。其发光信号强度在酶浓度为10⁻¹⁶ mol/L至10⁻⁸ mol/L的范围内与酶活性呈线性关系，并且在理想条件下可检测到低至10⁻²⁰ mol/L的荧光素酶活性。此外，荧光素酶报告基因系统具有非放射性、检测快速、灵敏度高(比氯霉素乙酰转移酶CAT高100倍)等优点，特别适用于高通量筛选和活细胞检测。通过将荧光素酶报告基因载体转染至宿主细胞后，可利用荧光素酶检测系统灵敏且便捷地监测基因表达水平，已成为细胞生物学研究中的重要工具。逸漠生物自主研发了近200种表达Fluc的细胞系，均经过荧光素酶活性检测验证，可满足科研人员的多样化需求，欢迎咨询。

基本信息

英文标题：Development of a stable luciferase@nanoflower-based method for the sensitive detection of pesticide residues in milk

中文标题：稳定的荧光素酶 @纳米花基方法用于牛奶中农药残留的灵敏检测

发表期刊：《Food Chemistry》

影响因子：9.8

作者单位：

1.Institute of State Key Laboratory for Quality and Safety of Agro - Products, Institute of Quality Standards and Testing Technology for Agro-Products, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100081, China

2.Institute of Food Science and Engineering, Qingdao Agricultural University, Qingdao, Shandong, 266109, China

作者信息：

Xiaoyu Li、Fengchun Huang、Juan Zhang、Jiaci Chen、Xiangyi Pang、Longrui Yang*、Xiaoyun Sun、Yuhang Fan、Ailiang Chen*、Qingli Yang(* 为通讯作者)

研究背景

萤火虫荧光素酶(FLuc)介导的乙酰胆碱酯酶抑制 - 生物发光系统可快速检测有机磷和氨基甲酸酯类农药残留，但 FLuc 存在稳定性差、发光持续时间短的缺陷，导致检测结果存在不确定性;传统纳米材料固定化酶技术易损伤酶活性，而纳米花作为新型有机 - 无机杂化材料，具有合成简单、环保、比表面积大等优势，能有效提升酶的稳定性和活性;牛奶中的农药残留通过饲料间接进入，传统检测方法灵敏度低、样品前处理复杂(需去除蛋白质、脂肪等基质干扰)，难以满足痕量残留检测需求，因此研究人员开发了基于 FLuc@纳米花(FLuc@NFs)的生物发光检测系统，旨在解决 FLuc 应用局限及食品中农药残留高效检测的问题。

研究方法

采用共沉淀法制备 FLuc@NFs，将 FLuc 溶液与 CaCl₂溶液在 PBS 中混合，25℃振荡孵育 12 小时后离心洗涤收集产物;通过扫描电子显微镜(SEM)、透射电子显微镜(TEM)、能量色散 X 射线光谱(EDS)对 FLuc@NFs 的形貌、结构及元素组成进行表征;利用手持发光光度计等仪器，比较 FLuc@NFs 与游离 FLuc 在 4℃和 25℃下的储存稳定性、不同浓度下的酶活性及发光持续时间;构建乙酰胆碱酯酶(AChE)-FLuc@NFs 生物发光检测系统，优化检测时间和酶浓度参数，绘制毒死蜱(有机磷农药)和西维因(氨基甲酸酯类农药)的标准曲线并计算检测限;在牛奶(巴氏杀菌奶、超高温灭菌奶)、黄瓜、圣女果等实际样品中进行加标回收实验，通过测定回收率和变异系数，验证该检测方法的适用性、准确性和可靠性。

实验结果

图 1：FLuc@NFs 的结构表征图(TEM、SEM、EDS 元素 mapping 及 EDS 光谱)

TEM 图像显示 FLuc@NFs 尺寸均匀，直径约 1-2μm;SEM 图像呈现出均匀分布的典型花状结构，由多个纳米片组成，比表面积大;EDS 元素 mapping 表明 Ca²⁺在 FLuc@NFs 中均匀分布，无明显富集区域;EDS 光谱显示其主要成分包括磷、氧、钙，含少量钠和氯(可能来自 PBS 缓冲液)，证实成功制备出结构完整、成分均一的 FLuc@NFs，为酶活性和稳定性提升奠定结构基础。

图 2：不同储存温度下生物发光值变化图(a：4℃储存;b：25℃储存)

随着储存时间延长，FLuc@NFs 与游离 FLuc 的活性均呈下降趋势，但 FLuc@NFs 的活性衰减速度显著慢于游离 FLuc。4℃储存 5 天时，游离 FLuc 活性降至 20%，而 FLuc@NFs 活性保持稳定;储存 15 天，FLuc@NFs 仍保留 40.93% 的活性，游离 FLuc 活性几乎完全丧失。25℃储存 3 天时，游离 FLuc 活性仅余 10%，FLuc@NFs 活性无明显变化;储存 10 天，FLuc@NFs 仍保留 36.35% 的活性，充分证明 FLuc@NFs 具有优异的储存稳定性。

图 3：FLuc@NFs 与游离 FLuc 的活性对比图

游离 FLuc 在浓度 1.5mg/mL 时达到最大发光值，之后趋于平稳;而 FLuc@NFs 在 1.0mg/mL 浓度下的发光值比相同浓度的游离 FLuc 高 62.14%，且在 1.5mg/mL 时与游离 FLuc 发光值相当。尽管 FLuc@NFs 中酶浓度与游离 FLuc 相近或略低，但纳米花的多孔层级结构为酶提供了稳定微环境，减少了酶聚集和变性，显著提升了酶的催化活性。

图 4：生物发光反应检测时间对比图(1mg/mL 浓度)

FLuc@NFs 的发光信号在 30 分钟内始终保持稳定，无明显衰减;游离 FLuc 的初始发光值比 FLuc@NFs 低 13.54%，且持续下降，8 分钟后趋于稳定，此时发光值比 FLuc@NFs 低 58.61%。该结果表明 FLuc@NFs 有效延长了发光持续时间，解决了游离 FLuc 发光易淬灭的问题，为高通量检测提供了便利。

图 5：检测时间及不同浓度酶的活性对比图(a：游离酶检测时间;b：纳米花检测时间;c：不同浓度酶活性对比)

游离 FLuc 在加入 ATP 后 10 秒达到发光峰值，随后快速下降，需在 10 秒内完成检测，对检测时效性要求极高;FLuc@NFs 在达到峰值后，30 分钟内发光值保持稳定，降低了检测操作难度，利于多样品同步检测。在毒死蜱加标体系中，1.0mg/mL 和 1.5mg/mL 的 FLuc@NFs 均表现出良好的抑制效果，而游离 FLuc 在 1.0mg/mL 时无明显发光信号，最终确定 1.0mg/mL 为最优酶浓度。

图 6：农药标准曲线(a：毒死蜱;b：西维因)

毒死蜱的标准曲线方程为抑制率(%)=27.13logC 毒死蜱 -5.584(R²=0.9530)，西维因的标准曲线方程为抑制率(%)=24.15logC 西维因 +3.200(R²=0.9817)，两者在 5-200ng/mL 浓度范围内均呈现良好的线性关系。以抑制率 > 15% 计算，毒死蜱和西维因的检测限分别为 10ng/mL 和 5ng/mL，灵敏度比传统酶抑制法提升约 10 倍，满足国家残留限量要求。

图 7：储存后检测系统的性能图(4℃储存 15 天或 25℃储存 10 天)

FLuc@NFs 经 4℃储存 15 天、25℃储存 10 天后，用于检测毒死蜱(检测限浓度及 200ng/mL 浓度)时，抑制率均超过 15%，符合农药残留检测的精度要求;随着农药浓度升高，抑制率相应提升至 37%-42%。结果表明，FLuc@NFs 经长时间储存后活性虽略有下降，但仍能稳定用于农药残留检测，进一步验证了其储存稳定性优势。

研究结论

本研究通过共沉淀法成功制备了 CaCl₂掺杂的 FLuc@纳米花(FLuc@NFs)，其具有完整的花状结构和均匀的元素分布，相比游离 FLuc，显著提升了酶活性(1mg/mL 浓度下发光强度高 62.14%)、延长了发光持续时间(30 分钟内稳定)和储存稳定性(4℃储存 15 天保留 40.93% 活性);构建的 AChE-FLuc@NFs 生物发光检测系统，对毒死蜱和西维因的检测限分别为 10ng/mL 和 5ng/mL，灵敏度是传统方法的 10 倍，且样品前处理简单(无需复杂基质去除);在牛奶、黄瓜、圣女果等实际样品中的加标回收实验显示，回收率为 88.37%-95.75%，变异系数为 1.46%-8.60%，适用于不同食品基质中有机磷和氨基甲酸酯类农药残留的快速、灵敏检测，为食品质量安全监控提供了高效可行的技术手段。