利用 TGF-β 信号优化分散睾丸细胞来源的睾丸类器官发育研究

睾丸类器官(TOs)作为生殖生物学研究的重要模型，在药物毒性评估和治疗应用中具有巨大潜力，但现有类器官常因精原细胞与功能性 niche 细胞失衡，难以复现天然睾丸的结构和功能。转化生长因子 -β(TGF-β)信号通路是睾丸发育的关键调控因子，前期研究发现抑制 TGF-β 可促进精原细胞增殖和分化。本研究通过抑制 TGF-β 信号，优化从分散睾丸细胞构建睾丸类器官的方法，旨在解决当前类器官结构和功能缺陷的问题。

来自伊朗 Royan 研究所的团队在《Stem Cell Research & Therapy》(2025 年，Vol. 16)发表了题为Harnessing TGF-β signaling to improve testicular organoid development from dissociated testicular cells的研究。核心内容如下：

研究方法：

睾丸细胞分离与培养：从青春期前小鼠睾丸分离细胞，封装于 Matrigel 核壳水凝胶中，构建 3D 培养体系;

TGF-β 抑制处理：培养 5 天后，用 TGF-β 抑制剂 SB431542(SB)或 LY2157299(LY)处理 11 天;

结构与功能评估：通过组织学(H&E 染色)分析球形管状结构(STSs)形成，免疫荧光检测细胞特异性标志物(如精原细胞 Ddx4、支持细胞 Vimentin)，ELISA 检测睾酮分泌，qRT-PCR 量化增殖和分化相关基因表达。

关键结果：

结构优化：TGF-β 抑制显著增加 STSs 的数量、大小和面积，形成类似天然睾丸的分隔结构，出现明显管腔;

细胞定位：STSs 周围可见 α-SMA⁺管周肌样细胞，内部有 Ddx4⁺精原细胞，支持细胞标志物 Vimentin 与紧密连接蛋白 ZO-1 共表达，提示血 - 睾屏障样结构形成;

功能增强：抑制剂处理的类器官(TiTOs)对促性腺激素(FSH/hCG)响应增强，睾酮分泌量为对照组的 3.0-3.69 倍;

增殖促进：TiTOs 中 Ddx4⁺/PCNA⁺增殖精原细胞比例增加，细胞周期促进基因(Cdk4、Cdc25a)上调，抑制基因(4Ebp1、P57)下调。

实验结果

图 1：TGF-β 抑制下睾丸类器官的发育过程

该图展示类器官培养与处理策略及形态变化。(A)示意图显示：青春期前小鼠睾丸细胞封装于 Matrigel 核壳水凝胶，培养 5 天后加入 SB 或 LY，持续 11 天至第 16 天;(B)明场图像显示，第 8 天和第 16 天，处理组出现明显分隔的管状结构(红色箭头)，对照组仅形成致密细胞聚集，无分隔特征。图示证实 TGF-β 抑制可诱导类器官形成类似天然睾丸的结构。

图 2：TGF-β 抑制对管状结构重建的影响

该图通过组织学验证结构优化。H&E 染色显示，处理组类器官(TiTOs)形成大量球形管状结构(STSs，黑色箭头)，部分含管腔(黄色箭头)，对照组则为致密无结构的细胞团;高倍镜下可见 TiTOs 的 STSs 呈圆形或索状，类似体内初级性索。图示表明 TGF-β 抑制显著促进管状结构重建。

图 3：STSs 的定量形态分析

该图量化结构改善效果。(A)TiTOs 的 STSs 数量显著多于对照组;(B)处理组 STSs 直径多为 40-60μm，对照组多为 20-40μm;(C)STSs 总面积增大;(D-E)含管腔的 STSs 比例及管腔效率(管腔面积 / STSs 面积)均显著提高。数据证实 TGF-β 抑制可增加 STSs 的数量、大小及成熟度。

图 4：睾丸细胞特异性标志物的免疫荧光分析

该图验证细胞组成与定位。(A)全 mount 染色显示，STSs 周围有 α-SMA⁺管周肌样细胞，内部有 Ddx4⁺精原细胞;(B)切片染色显示，Vimentin⁺支持细胞与 ZO-1⁺紧密连接蛋白共定位，提示血 - 睾屏障样结构形成。图示证实 TiTOs 包含主要睾丸细胞类型且定位合理。

图 5：支持细胞与间质细胞的分布

该图解析细胞区室化特征。(A)β-catenin⁺支持细胞位于 STSs 内部，3β-HSD⁺间质细胞分布于 STSs 间隙;(B-C)定量显示 TiTOs 中 β-catenin⁺和 3β-HSD⁺细胞比例显著高于对照组。图示表明 TiTOs 重现睾丸的管状 - 间质区室化结构。

图 6：增殖精原细胞的检测

该图证实增殖能力增强。(A)共聚焦显示 TiTOs 中 Ddx4⁺精原细胞与 PCNA⁺增殖细胞共定位;(B-D)定量显示，处理组 Ddx4⁺细胞、PCNA⁺细胞及 Ddx4⁺/PCNA⁺增殖精原细胞比例均显著升高，SB 和 LY 处理分别使增殖精原细胞增加 2.28 倍和 2.23 倍。图示表明 TGF-β 抑制促进精原细胞增殖。

图 7：类器官的类固醇生成活性

该图验证激素响应功能。促性腺激素(FSH/hCG)处理后，TiTOs 的睾酮分泌量显著升高，SB 和 LY 组分别为对照组的 3.69 倍和 3.00 倍，对照组无明显变化。图示证实 TiTOs 具有功能性类固醇生成能力。

图 8：关键基因的表达分析

该图揭示分子调控机制。(A)精原细胞标志物(Gfra1、Ddx4)、减数分裂相关基因(Smc1b、Prm1)及支持细胞基因(Sox9)在 TiTOs 中上调;(B)TGF-β 信号下游分子(Smad2/3、Id1/2)下调;(C)增殖基因(Ki67、Pcna)和细胞周期促进基因(Cdk4、Cdc25a)上调，抑制基因(4Ebp1、P57)下调。图示证实 TGF-β 抑制通过调控细胞周期和分化基因促进类器官发育。

全文总结

本研究通过抑制 TGF-β 信号，成功从分散睾丸细胞构建出结构和功能更优的睾丸类器官(TiTOs)。核心发现包括：TGF-β 抑制剂(SB、LY)显著促进球形管状结构(STSs)形成，增加其数量、大小及管腔效率，重现天然睾丸的管状 - 间质区室化;TiTOs 包含精原细胞、支持细胞、间质细胞等主要类型，形成血 - 睾屏障样结构;对促性腺激素响应增强，睾酮分泌能力提升，且精原细胞增殖显著增加，这与细胞周期促进基因上调、抑制基因下调相关。

创新点在于首次证实靶向 TGF-β 信号可改善睾丸类器官的结构完整性和功能，提供了一种简单高效的优化策略。局限性包括依赖小鼠细胞(需验证人类来源)、未长期追踪 spermatogenesis 完整过程。未来可结合人类睾丸细胞验证，并探索该策略与其他培养系统的协同效应，为男性不育研究和药物筛选提供更可靠的模型。