利用天然血管微环境的单 BMSC 来源软骨类器官用于梯度异质性骨软骨再生研究

骨软骨缺损(OCDs)修复面临巨大挑战，因其涉及软骨、钙化软骨和软骨下骨三层梯度异质结构，各层微环境差异显著：软骨层无血管依赖滑液获取营养，软骨下骨高度血管化提供结构支撑，而钙化软骨层作为过渡结构连接两者。传统治疗方法(如关节镜清创、干细胞移植)难以复现这种梯度异质性，导致修复效果不佳。

类器官技术为解决这一问题提供了新思路，但现有软骨类器官研究难以同时诱导软骨和骨再生，且缺乏对血管化梯度的利用。本研究提出利用单个骨髓间充质干细胞(BMSC)衍生的软骨类器官，借助骨软骨组织天然的血管化梯度，调控类器官向软骨和骨定向分化，实现梯度异质性骨软骨再生，为临床修复提供新策略。

来自中国同济大学的团队在《Journal of Nanobiotechnology》(2025 年，Vol. 23)发表了题为Single BMSC-derived cartilage organoids for gradient heterogeneous osteochondral regeneration by leveraging native vascular microenvironment的研究。

核心内容如下：

研究方法：

BMSC 分离与鉴定：从兔骨髓分离 BMSCs，通过流式细胞术验证表面标志物(CD29、CD44 阳性，CD34、CD45 阴性)，并评估其成骨和成软骨分化潜能;

软骨类器官构建：利用 3% 琼脂糖模具培养 P3 代 BMSCs，通过软骨诱导培养基(含 TGF-β3 等)形成软骨类器官，对比 2D 与 3D 培养的细胞活力和软骨标志物(COL II、Aggrecan)表达;

血管微环境调控：体外通过 VEGF 模拟促血管环境，Axitinib(抗血管药物)模拟抗血管环境，检测类器官的肥大分化(COL X、Mmp13)和软骨分化标志物;体内构建双层类器官 / GelMA 复合物(含 / 不含 Axitinib)，皮下植入裸鼠验证血管化对分化的影响;

骨软骨缺损修复：在兔 OCD 模型中植入类器官 / GelMA 圆柱体，通过 Micro-CT、组织染色评估 12 周后梯度再生效果。

关键结果：

BMSC 特性：P3 代 BMSCs 具有最佳增殖能力和分化潜能，CD29、CD44 表达率达 70% 以上，成骨(茜素红染色)和成软骨(阿尔新蓝染色)能力显著;

软骨类器官特性：3D 培养的 BMSC 球在 28 天内发育为直径约 190μm 的软骨类器官，表达 COL II 和 Aggrecan，GAG/DNA 和 COL II/DNA 比值显著高于 2D 培养，细胞活力和增殖能力更优;

血管微环境调控：体外实验中，VEGF 处理使类器官肥大标志物(COL X、Mmp13)上调，软骨标志物(COL II、Sox9)下调;Axitinib 处理则抑制血管形成，维持软骨分化表型;

体内验证：裸鼠皮下植入实验中，(+) Axitinib 组形成软骨组织(高 GAG 和 COL II)，(-) Axitinib 组形成骨组织(高骨小梁数量和厚度)，双层复合物实现软骨 - 骨分层再生;

骨软骨缺损修复：兔 OCD 模型中，类器官 / GelMA 组 12 周后 ICRS 评分最高，形成连续的软骨层、过渡层和软骨下骨，Micro-CT 显示骨体积分数(BV/TV)和骨小梁厚度(Tb.Th)显著优于对照组，且无全身毒性。

实验结果

图 1：兔 BMSC 的分离与鉴定

该图展示 BMSC 的形态、表面标志物及分化潜能。(A)P0 代 BMSC 培养 3-12 天的形态，从分散到融合;(B)P2-P6 代细胞骨架染色，P2-P3 代形态舒展，P4 后收缩;(C-D)流式细胞术显示 CD29、CD44 高表达(P0-P7 均 > 65%)，CD34、CD45 低表达(<1%);(E-H)成骨(茜素红)和成软骨(阿尔新蓝)染色显示 P3 代分化能力最强。图示证实 P3 代 BMSC 适合类器官构建。

图 2：基于琼脂糖平台的软骨类器官发育

该图对比 2D 与 3D 培养的类器官形成。(A-B)3D 打印模具及琼脂糖微腔结构，每孔约 2000 个微腔;(C)3D 培养 28 天形成类器官，2D 培养仅单层生长;(D)H&E 染色显示类器官随时间细胞密度增加，ECM 均匀分布;(E)免疫荧光证实 28 天类器官高表达 COL II 和 Aggrecan。图示验证 3D 培养对类器官形成的必要性。

图 3：VEGF 对软骨类器官分化的调控

该图验证血管微环境的体外作用。(A)实验设计：类器官 ±VEGF 处理 4 周;(B)qPCR 显示 (+) VEGF 组 Col10a1、Mmp13 上调，Col2a1、Sox9 下调;(C-D)Western blot 证实蛋白水平趋势一致;(E-F)免疫荧光显示 (+) VEGF 组 COL X、Mmp13 增强，(-) VEGF 组 COL II、GAG 更显著。图示明确 VEGF 促进类器官肥大分化。

图 4：类器官差异基因表达分析

该图解析 VEGF 调控的分子机制。(A-B)火山图和热图显示 41 个上调基因、12 个下调基因;(C)(+) VEGF 组血管生成(VEGFA、NOTCH1)、成骨(BMP2、BGLAP)基因上调，软骨生成(SOX9、COL2A1)基因下调;(D-G)GO 和 KEGG 分析显示上调基因富集血管生成、成骨通路，下调基因富集软骨分化通路。图示揭示 VEGF 通过多通路调控分化。

图 5：裸鼠体内类器官 / GelMA 复合物的分化

该图展示体内血管微环境的调控效果。(A)实验设计：双层复合物 ±Axitinib 皮下植入;(B-C)H&E 和 Saf-O/FG 染色显示，(+) Axitinib 组生成软骨，(-) Axitinib 组生成骨，双层组分层再生;(D-G)量化显示 (+) Axitinib 组 GAG、COL II 更高，(-) Axitinib 组 CD31(血管标记)表达更强。图示验证体内血管微环境的定向分化作用。

图 6：兔 OCD 模型的梯度骨软骨再生

该图呈现修复效果。(A)实验设计：类器官 / GelMA 圆柱体植入缺损;(B)大体观察和 Micro-CT 显示，类器官组新生组织与周围整合良好，骨小梁更多;(C)类器官组 ICRS 评分、BV/TV 和 Tb.Th 显著最高;(D-E)H&E 和 Saf-O/FG 染色显示类器官组形成软骨层、过渡层和骨层，梯度结构完整。图示证实该策略实现功能性修复。

全文总结

本研究利用单个 BMSC 衍生的软骨类器官，结合骨软骨组织天然的血管化梯度，实现了梯度异质性骨软骨再生。核心发现包括：P3 代 BMSC 在 3D 培养中可形成高活性软骨类器官，表达 COL II 等软骨标志物;血管微环境是分化关键 ——VEGF 促进类器官肥大分化(向骨方向)，Axitinib 营造的抗血管环境维持软骨表型;体内实验中，类器官 / GelMA 复合物在裸鼠皮下实现软骨 - 骨分层再生，在兔 OCD 模型中形成完整的梯度结构，ICRS 评分和骨参数显著优于对照组，且具有生物安全性。

创新点在于首次利用单一干细胞类器官和天然血管梯度，避免了构建两种类器官的复杂性，简化了梯度再生流程。局限性包括依赖动物模型(需验证人类 BMSC)、类器官成熟度接近胎儿组织等。未来可优化类器官培养体系，结合生物打印技术提升临床转化潜力，为骨软骨缺损修复提供新范式。