TLR2 和 AP-1/NF-κB 参与热杀死单核细胞增生李斯特菌诱导人单核细胞 THP-1 产生 MMP-9 的调控

Reporter THP1 Cell Line 细胞系是以 THP-1 为工具细胞，采用慢病毒感染的方式，构建稳定表达报告基因的细胞系，可用于检测信号通路转导。在被PMA、INF-α等刺激后，目标信号通路被激活，会启动下游特定基因的表达，这个表达过程会同时带动“报告基因”的表达。通过检测报告基因的信号强度，可以间接、定量、灵敏地衡量该信号通路的激活程度。

THP-1细胞本身来源于人单核细胞，可以分化为巨噬细胞样细胞，是研究先天免疫的经典模型。报告基因株的建立使其功能更强大。THP-1报告基因株是免疫学、炎症性疾病、药物研发等领域不可或缺的强大工具。它可以将一个复杂的、内在的生物学过程(信号通路激活/基因表达)转变为一个易于检测、可定量的物理信号(光或荧光)。这使得研究人员能够高通量地筛选药物，精确地量化免疫反应强度，直观地研究信号通路机制。

基本信息

英文标题：TLR2 and AP-1/NF-kappaB are involved in the regulation of MMP-9 elicited by heat killed Listeria monocytogenes in human monocytic THP-1 cells

中文标题：TLR2 和 AP-1/NF-κB 参与热杀死单核细胞增生李斯特菌诱导人单核细胞 THP-1 产生 MMP-9 的调控

发表期刊：《Journal of Inflammation》

影响因子：10.1

作者单位：

Immunology & Innovative Cell therapy Unit, Dasman Diabetes Institute, Al-Soor Street, P.O. Box 1180, Dasman 15462, Kuwait

作者信息：

Puthiyaveetil Kochumon Shihab、Areej Al-Roub、Moneera Al-Ghanim、Anfal Al-Mass、Kazem Behbehani、Rasheed Ahmad*(* 为通讯作者)

研究背景

基质金属蛋白酶 9(MMP-9)对正常免疫反应至关重要，但过量释放会导致严重组织损伤，其在多种炎症和感染性疾病中水平升高。单核细胞增生李斯特菌(LM)是一种食源性机会致病菌，可引发李斯特菌病、脑膜炎和败血症，热杀死的单核细胞增生李斯特菌(HKLM)能激活免疫系统，诱导细胞因子和趋化因子产生，但 HKLM 对 MMP-9 的调控作用尚不明确。TLR2 在 LM 感染的先天免疫反应启动中起关键作用，其信号传导依赖衔接蛋白 MyD88，进而激活 NF-κB 和 MAPK 通路，而 NF-κB 和 AP-1 转录通路参与炎症介质调控，可能与 MMP-9 表达相关。因此，本研究旨在探究 HKLM 对人单核细胞 THP-1 中 MMP-9 基因表达的调控作用及相关信号通路。

研究方法

本研究以人单核细胞白血病细胞系 THP-1、稳定表达 NF-κB/AP-1 报告基因的 THP-1-XBlue™细胞、MyD88 缺陷型 THP-1-XBlue™-defMyD 细胞为研究模型，采用不同浓度的 HKLM 刺激细胞，通过实时定量 PCR 和 ELISA 检测 MMP-9 的 mRNA 和蛋白表达水平;利用 TLR2 中和抗体阻断 TLR2 功能，观察 MMP-9 表达变化;借助 THP-1-XBlue™细胞检测 HKLM 对 NF-κB/AP-1 活性的影响;使用 JNK、MEK/ERK、p38 MAPK 及 NF-κB 通路的特异性抑制剂，探究相关信号通路在 HKLM 诱导 MMP-9 表达中的作用;通过 Western blot 检测磷酸化及总蛋白水平，验证信号通路的激活状态;以 TNF-α 作为阳性对照，TIMP-1 作为对照指标，确保实验的特异性和可靠性。

实验结果

图1：HKLM 上调 THP-1 细胞中 MMP-9 的表达

(A、B)HKLM 以剂量依赖性方式诱导 THP-1 细胞中 MMP-9 的 mRNA 和蛋白表达，选取 3×10⁷颗粒 /ml(无细胞毒性)作为后续实验浓度;(C)HKLM 刺激后，细胞上清中 TIMP-1 蛋白水平无显著变化;(D、E)与未刺激组相比，HKLM 刺激组 MMP-9 mRNA 表达升高 395 倍(P=0.002)，蛋白水平达 8141±215 pg/ml(P=0.003)，均高于 TNF-α 阳性对照组;(F)HKLM 可激活 THP-1-XBlue™细胞中 NF-κB/AP-1，使 SEAP 报告基因活性显著升高(P=0.0018)，表明 NF-κB/AP-1 参与 HKLM 诱导的 MMP-9 表达调控。

图2：TLR2 中和抗体对 HKLM 诱导 MMP-9 表达的影响

THP-1 细胞预处理 TLR2 中和抗体后，HKLM 诱导的 MMP-9 mRNA(A)和蛋白(B)表达均被显著抑制(P 分别为 0.0024 和 0.0008)，且表达水平接近未刺激组，而同型对照抗体(IgA)无此作用;(C)TLR2 中和抗体还能显著降低 HKLM 诱导的 NF-κB/AP-1 活性(P=0.0116)，证实 TLR2 介导的信号通路是 HKLM 诱导 MMP-9 表达的必要条件。

图3：MyD88 缺陷对 HKLM 诱导 MMP-9 表达的影响

MyD88 缺陷型 THP-1-XBlue™-defMyD 细胞经 HKLM 刺激后，MMP-9 的 mRNA(A)和蛋白(B)表达均显著降低，而 TNF-α 诱导的 MMP-9 表达不受影响(TNF-α 通过 MyD88 非依赖途径激活);(C)MyD88 缺陷也完全阻断了 HKLM 诱导的 NF-κB/AP-1 激活，表明 MyD88 在 HKLM 介导的 MMP-9 表达及 NF-κB/AP-1 激活中起关键作用。

图4：HKLM 激活 MAP 激酶信号通路及其对 MMP-9 表达的影响

(A)Western blot 结果显示，HKLM 刺激能时间依赖性地增加 MEK1/2、ERK1/2、JNK、p38 及 c-Jun 的磷酸化水平;(B、C)MEK/ERK 抑制剂(U0126、PD98059)、JNK 抑制剂(SP600125)、p38 抑制剂(SB203580)均能显著抑制 HKLM 诱导的 MMP-9 mRNA 和蛋白表达(P<0.05)，证实 MAPK 通路参与 HKLM 介导的 MMP-9 上调。

图5：NF-κB 通路抑制剂对 HKLM 诱导 MMP-9 表达的影响

(A)HKLM 刺激可增加 IKKα/β、IkB 及 NF-κB 的磷酸化水平，激活 NF-κB 通路;(B、C)NF-κB 抑制剂(BAY 11–7085、Triptolide、Resveratrol)能显著抑制 HKLM 诱导的 MMP-9 mRNA 和蛋白表达(P<0.0001)，表明 NF-κB 通路在 MMP-9 表达调控中不可或缺。

研究结论

本研究证实热杀死的单核细胞增生李斯特菌(HKLM)能显著上调人单核细胞 THP-1 中 MMP-9 的 mRNA 和蛋白表达，且该过程依赖 TLR2/MyD88 信号通路，TLR2 中和抗体或 MyD88 缺陷可完全阻断 HKLM 诱导的 MMP-9 产生。机制上，HKLM 通过激活 MAPK(MEK/ERK、JNK、p38)和 NF-κB 信号通路，进而激活转录因子 AP-1/NF-κB，最终调控 MMP-9 的基因表达，相关通路抑制剂能显著抑制 MMP-9 的表达。这些结果表明 MMP-9 可能是阻止感染或慢性炎症导致严重组织损伤的潜在治疗靶点，为相关疾病的治疗提供了新的分子机制和研究方向。