全合成水凝胶促进肠道类器官中稳健的隐窝形成研究

肠道类器官作为模拟肠道结构和功能的 3D 模型，在器官发生研究、疾病建模和药物筛选中具有重要价值。传统培养依赖生物基质(如 Matrigel)，但其成分复杂(含高浓度层粘连蛋白等)、可控性差，限制了对细胞 - 基质相互作用的机制研究。现有合成水凝胶虽能模拟力学特性，但均需外源性层粘连蛋白才能促进隐窝形成，无法区分内源性(细胞分泌)与外源性层粘连蛋白的作用。本研究开发了一种基于硼酸盐酯的合成水凝胶，其具有快速应力松弛特性，无需外源性层粘连蛋白即可支持肠道类器官隐窝形成，为解析肠道类器官 - 基质相互作用及优化合成培养体系提供了新工具。

来自美国科罗拉多大学的团队在《bioRxiv》(2024 年预印本)发表了题为Fully synthetic hydrogels promote robust crypt formation in intestinal organoids的研究。

核心内容如下：

研究方法：

合成水凝胶构建：采用 8 臂聚乙二醇(PEG)大分子，通过 SPAAC 反应形成永久性交联，同时通过氟苯基硼酸(FPBA)与硝基多巴胺(ND)的硼酸盐酯键形成动态可逆交联，构建具有快速应力松弛特性的共价自适应网络(CAN);

肠道类器官培养：从小鼠小肠隐窝分离干细胞，在合成水凝胶中培养，对比有无外源性层粘连蛋白(-Lam/+Lam)的隐窝形成效率(CFE);

机制验证：通过整合素 α6/β4 阻断抗体、FAK 抑制剂干预，结合免疫荧光、非经典氨基酸标记等技术，分析层粘连蛋白沉积、细胞 - 基质相互作用及新生蛋白分泌的影响。

关键结果：

水凝胶特性：硼酸盐酯基水凝胶可在几秒内松弛 80% 应力，模量可调(500-2000 Pa)，4.2 wt% 配方(≈1 kPa)最适合类器官存活;

隐窝形成：无需外源性层粘连蛋白(-Lam)即可实现与 + Lam 组相当的 CFE(≈75%)，是首个无需外源性层粘连蛋白的合成体系;

机制发现：类器官通过分泌内源性层粘连蛋白，与整合素 α6β4 结合调控隐窝形成，阻断后 CFE 降至 25% 以下，且隐窝变短、数量减少;FAK 抑制剂处理呈现类似表型，证实 focal adhesion 信号参与该过程;

应力松弛的作用：粘弹性水凝胶(+ND)中，类器官分泌的层粘连蛋白在隐窝区域更厚(约 95μm)、覆盖率达 75%，而弹性水凝胶(-ND，无动态键)层粘连蛋白沉积减少，且无外源性层粘连蛋白时无法形成隐窝;

新生蛋白分泌：非经典氨基酸标记显示，粘弹性水凝胶中类器官分泌的新生蛋白更多，隐窝区域基质覆盖率(>75%)显著高于类器官体(<50%)，弹性水凝胶则分泌减少。

实验结果

图 1：硼酸盐酯 PEG 水凝胶的化学结构与力学特性

该图展示水凝胶的构建原理及应力松弛能力。(A)永久交联：DBCO 与叠氮基团通过 SPAAC 反应形成稳定网络;(B)动态交联：FPBA 与 ND 形成可逆硼酸盐酯键，赋予粘弹性;(C)网络结构：由三种 8 臂 PEG 大分子组成，兼具稳定性与应力松弛特性;(D-E)应力松弛：水凝胶在几秒内松弛 80% 应力，快于 Matrigel，且与模量无关;(F)模量调控：3.8-4.6 wt% PEG 对应 500-2000 Pa 模量;(G-J)4.2 wt% 水凝胶中类器官存活率最高，F-actin 显示上皮极化良好。图示证实水凝胶的力学可调性与生物相容性。

图 2：无外源性层粘连蛋白时的隐窝形成

该图验证水凝胶的核心优势。(A)实验流程：类器官包埋于水凝胶，分化 48 小时后固定;(B)CFE 量化：-Lam 与 + Lam 组无显著差异(≈75%);(C-D)免疫荧光显示，两组均形成含溶菌酶 + 潘氏细胞的隐窝(白色箭头)。图示首次证实合成水凝胶无需外源性层粘连蛋白即可支持隐窝形成。

图 3：整合素 α6β4 介导层粘连蛋白相互作用

该图解析细胞 - 基质相互作用的分子机制。(A)作用模型：整合素 α6β4 为层粘连蛋白特异性受体;(B)阻断效果：α6/β4 抗体处理后，-Lam 和 + Lam 组 CFE 均降至 25% 以下;(C-D)隐窝参数：阻断后隐窝变短(≈40μm)、数量减少(0.5 个 / 集落);(E-L)表型异常：出现无潘氏细胞的芽体或无芽体的潘氏细胞，证实层粘连蛋白调控隐窝对称性破缺。图示明确整合素 α6β4 在隐窝形成中的核心作用。

图 4：FAK 抑制剂影响隐窝形成

该图关联 focal adhesion 信号与层粘连蛋白作用。(A-D)表型观察：FAK 抑制剂处理后，隐窝形成减少;(E-G)量化显示 CFE 下降、隐窝数量和大小减少，与整合素阻断表型一致。图示证实层粘连蛋白通过 focal adhesion 信号(如 FAK)调控隐窝发育。

图 5：应力松弛促进内源性层粘连蛋白沉积

该图对比粘弹性与弹性水凝胶的差异。(A-C)内源性沉积：-Lam 组类器官分泌层粘连蛋白，隐窝区域更厚(≈95μm)、覆盖率 75%;(D-E)弹性水凝胶(-ND)：仅含永久键，无动态交联;(F-H)功能差异：-ND 组 - Lam 时无隐窝，+Lam 可挽救;(I-L)沉积差异：-ND 组层粘连蛋白沉积少(25% 集落)、厚度薄。图示揭示应力松弛是内源性层粘连蛋白沉积的关键。

图 6：粘弹性促进新生蛋白分泌

该图展示力学特性对细胞分泌的影响。(A)标记方法：甲硫氨酸类似物 HPG 标记新生蛋白，通过铜催化反应荧光显色;(B-C)定位验证：仅 extracellular 蛋白被标记(与细胞膜染色区分);(D-E)区域差异：隐窝区域新生蛋白更厚、覆盖率 > 75%;(F-J)粘弹性依赖：+ND 组分泌更多，基质厚度和覆盖率显著高于 - ND 组。图示证实粘弹性增强类器官的新生蛋白分泌，尤其在隐窝区域。

全文总结

本研究开发了一种基于硼酸盐酯的全合成水凝胶，其通过快速应力松弛特性，无需外源性层粘连蛋白即可支持肠道类器官隐窝形成，为解析肠道 - 基质相互作用提供了全新模型。核心发现包括：该水凝胶兼具力学可调性与生物相容性，4.2 wt% 配方最适合类器官存活;类器官通过分泌内源性层粘连蛋白，与整合素 α6β4 结合并经 FAK 信号调控隐窝形成;粘弹性(而非弹性)是促进内源性层粘连蛋白和新生蛋白沉积的关键，隐窝区域的高分泌量保障了结构形成。

该研究首次证实合成基质可通过力学特性调控细胞自主分泌功能，替代生物基质中的关键成分，为肠道类器官的标准化培养和临床转化(如减少免疫原性)奠定基础。局限性包括依赖小鼠类器官(需验证人类来源)、未探究长期培养效果等。未来可优化水凝胶力学参数，拓展至人类肠道类器官模型，深入研究力学 - 分泌耦合的分子机制。