内耳类器官的振动切片、免疫荧光及 S 期标记实验方案

内耳类器官(inner ear organoids)源于多能干细胞，可模拟内耳发育，生成包括感觉毛细胞、支持细胞在内的听觉相关细胞，为研究内耳发育、听力障碍机制及再生医学提供了理想模型。然而，这类类器官体积小(尤其早期)、结构脆弱(囊性形态)，传统切片和分析方法易导致样本损伤，且难以同时评估细胞增殖与特异性蛋白表达。本研究建立了一套完整的实验方案，通过 5 - 乙炔基 - 2'- 脱氧尿苷(EdU)标记 S 期增殖细胞，结合琼脂糖包埋、振动切片和免疫荧光技术，实现对内耳类器官的结构观察、细胞增殖动态及特异性标志物的同步分析，解决了小型脆弱类器官的处理难题，为内耳发育和疾病研究提供了标准化工具。

来自美国斯坦福大学的团队在《STAR Protocols》(2025 年，Vol. 6)发表了题为Protocol for vibratome sectioning, immunofluorescence, and S-phase labeling of inner ear organoids的实验方案。

核心内容如下：

研究方法：

内耳类器官构建：从小鼠胚胎干细胞(mESCs)出发，通过调控 BMP、Wnt、FGF 等信号通路(如 DIV1 添加 Matrigel，DIV3 用 BMP-4 和 RepSox 诱导，DIV4 用 FGF-2 和 LDN-193189 促进耳前体细胞分化)，在 21 天内生成含感觉上皮的类器官;

S 期细胞标记：类器官成熟阶段(≥3 周)用 10 μM EdU 处理 24 小时(或 0.3 μM 处理 72 小时)，标记进入 S 期的增殖细胞;

样本处理：类器官经 4% 多聚甲醛固定后，包埋于 4% 低熔点琼脂糖中，使用振动切片机切成 70-100 μm 切片;

免疫荧光检测：切片经通透、封闭后，用 Click-iT 试剂盒检测 EdU，同时孵育特异性抗体(如 SOX2、MYO7A、ECAD)，通过荧光二抗和 DAPI 复染，实现增殖细胞与细胞类型标志物的共定位分析。

关键结果：

方案有效性：EdU 处理 24 小时(10 μM)或 72 小时(0.3 μM)无明显毒性，可特异性标记 S 期细胞，与 SOX2(支持细胞 / 毛细胞前体)、MYO7A(毛细胞)等标志物共定位，清晰显示增殖细胞的分布;

技术优势：琼脂糖包埋保护脆弱类器官，振动切片可获得完整的 70-100 μm 切片，避免传统切片的机械损伤;免疫荧光可同时检测多种标志物，结合共聚焦显微镜实现高分辨率成像;

适用性：该方案不仅适用于小鼠内耳类器官，还可扩展至其他小型类器官(如脑、视网膜类器官)，支持细胞增殖与分化的动态研究。

实验结果

图 1：小鼠胚胎干细胞(mESCs)生成内耳类器官的流程

该图展示类器官诱导的分阶段分化路径。(A)时间线：从 DIV0(mESCs 接种)到 DIV21，通过调控信号通路逐步分化为中内胚层(ME)、定形外胚层(DE)、非神经外胚层(NNE)、耳前体外胚层(PPE)、耳前体囊泡(OPV)，最终形成感觉上皮囊泡(SEV);(B)关键因子：DIV1 添加 Matrigel 促进聚集，DIV3 用 BMP-4 和 RepSox(抑制 TGFβ)诱导外胚层分化，DIV4 用 FGF-2 和 LDN-193189(抑制 BMP)促进耳前体形成，DIV8 后用成熟培养基和 CHIR99021(激活 Wnt)促进感觉上皮成熟。图示清晰呈现从干细胞到功能性内耳类器官的定向分化过程。

图 2：内耳类器官的包埋、振动切片与免疫染色流程

该图详解样本处理的关键步骤。(A-C)包埋：类器官从 PBS 转移至冷冻模具，去除液体后加入 4% 琼脂糖，均匀分布并冷却凝固;(D-G)切片：琼脂糖块固定于样本台，刀片呈 15° 角，设置速度 0.8 mm/s、振幅 0.9 mm、厚度 70-100 μm，连续切片;(H-M)染色与 mounting：切片用活检打孔器分离，经通透、EdU 检测、抗体孵育后，转移至载玻片的 Secure-Seal 垫片中，滴加封片液并覆盖盖玻片。图示直观展示从样本准备到成像的完整操作，强调避免气泡、保护样本完整性的关键细节。

图 3：振动切片的内耳类器官免疫荧光结果

该图验证标志物表达的时空特异性。(A)DIV3-DIV11 类器官切片：SOX2(神经前体 / 支持细胞标志物)与 ECAD(上皮标志物)共定位，显示早期感觉上皮的形成，随发育(DIV8-DIV11)SOX2 信号在特定区域富集;(B)DIV16-DIV21 类器官：SOX2 与 MYO7A(毛细胞特异性标志物)共定位，可见 MYO7A + 细胞排列成簇，提示感觉毛细胞成熟。标尺 50 μm，证实该方案可清晰区分不同发育阶段的细胞类型。

图 4：EdU 标记与免疫荧光的共定位分析

该图展示增殖细胞与功能细胞的关联。DIV24 类器官经 10 μM EdU 处理 24 小时后，EdU + 细胞(S 期增殖细胞)与 SOX2 + 细胞部分重叠，提示支持细胞或前体细胞仍在增殖;MYO7A + 毛细胞中 EdU 信号极少，表明成熟毛细胞退出细胞周期。DAPI 显示细胞核，证实该方案可同时解析细胞增殖状态与分化表型，为研究内耳细胞再生提供可视化工具。

图 5：EdU 处理的毒性验证

该图评估 EdU 浓度与处理时间的安全性。(A-B)DIV18-DIV20 类器官：10 μM EdU 处理 24 小时与未处理组相比，SOX2 + 细胞分布及形态无明显差异;(C-D)DIV24 类器官：0.3 μM EdU 处理 72 小时同样无明显毒性，细胞结构完整。结果支持该方案中 EdU 浓度和处理时间的合理性，为长期增殖研究提供依据。

全文总结

本研究建立了一套标准化实验方案，实现内耳类器官的 S 期细胞标记、振动切片与多标志物免疫荧光分析。核心价值在于：通过低熔点琼脂糖包埋解决小型脆弱类器官的切片难题，70-100 μm 振动切片保留组织结构完整性;EdU 标记结合特异性抗体，可同步分析细胞增殖与分化状态，且 10 μM(24 h)或 0.3 μM(72 h)EdU 无明显毒性，确保结果可靠性。

该方案的优势包括：操作流程明确(从类器官诱导到成像全程可重复)、适用性广(可扩展至其他小型类器官)、分辨率高(支持共聚焦显微镜下精细结构观察)。局限性在于切片厚度可能影响深层信号检测(可通过提高通透剂浓度或延长孵育时间改善)，且依赖高质量抗体减少背景干扰。

未来可应用于内耳发育中细胞增殖动态追踪、听力损伤模型中再生细胞来源分析，以及药物筛选中增殖调控效果评估，为内耳生物学和再生医学研究提供关键技术支撑。