浓缩生长因子来源细胞的多向分化能力研究：脂肪、内皮及神经样细胞分化潜力探索

浓缩生长因子(CGF)是再生医学中常用的自体血液制品，富含生长因子与细胞，但此前仅明确其来源细胞(CPCs)的成骨分化能力，其他谱系分化研究匮乏。

意大利萨兰托大学团队在《International Journal of Molecular Sciences》发表题为Cells Derived from Concentrated Growth Factor Exhibit a Multilineage Differentiation Capacity研究：从健康供体 CGF 中分离培养 CPCs，发现其表达干细胞标志物(CD105、Oct3/4、Nanog)，在特定诱导条件下可分化为脂肪细胞、内皮细胞及神经样细胞，分化能力与骨髓间充质干细胞(BMSCs)相当;通过油红 O 染色、免疫荧光、qPCR 等证实，分化细胞表达对应谱系特异性标志物(如脂肪的 PPARγ、内皮的 eNOS、神经的 TUBB3)。该研究填补了 CGF 细胞多向分化研究的空白，为 CPCs 在多组织再生治疗中的应用提供实验依据。

研究背景：CGF 作为第三代自体血小板浓缩物，含高浓度生长因子(VEGF、TGF-β 等)及异质性细胞群，已用于口腔、整形等再生场景，但此前仅证实 CPCs 可成骨分化，其向脂肪、内皮、神经等谱系的分化潜力尚未明确;外周血单核细胞等具有一定可塑性，而 CPCs 与单核细胞标志物(CD14、CD45)重叠，推测其可能具备多向分化能力，需进一步验证。

实验方法：纳入 5 名 27-50 岁健康供体，采集 8mL 静脉血离心制备 CGF;培养 14 天后切割 CGF，分离 CPCs 并传代;分别用含 IBMX / 地塞米松的培养基(脂肪)、M199+VEGF(内皮)、分四步的血清 - free 培养基(神经)诱导分化，以 BMSCs 为对照;通过油红 O 染色(脂肪脂质)、免疫荧光(谱系标志物)、qPCR(基因表达)、Western blot(蛋白)及 ImageJ 形态计量分析验证分化效果，PCA 分析形态数据，GraphPad Prism 进行统计。

实验结果：CPCs 表达 CD105、CD45、CD31、CD14，Oct3/4 与 Nanog mRNA 水平与 BMSCs 相当;脂肪诱导后油红 O 阳性，PLIN2、FABP4 等基因及 PPARγ 蛋白上调;内皮诱导后 eNOS、VEGFR-2、CD31 表达升高;神经诱导后 TUBB3、Nestin、NFL 上调，细胞呈神经样分支形态;CPCs 分化能力与 BMSCs 无显著差异，仅部分标志物表达强度略有不同。

实验方法

CGF 收集与 CPCs 分离培养：采集 5 名健康供体 8mL 静脉血，用 Medifuge 离心(2700-3000rpm 梯度)制备 CGF，PBS 洗涤后用 DMEM 低糖培养基培养 14 天;切割 CGF 为 8 块，接种于 6cm 板，用含 10% FBS、2ng/mL FGF-2 的 DMEM 培养，CPCs 贴壁生长至汇合，传代 2 次后以 1.5×10⁴ cells/mL 接种于 24 孔板用于分化实验，全程遵循赫尔辛基宣言，获取供体知情同意。

BMSC 培养：采用 ATCC 来源 BMSCs(PCS-500-012)，用含 10% FBS、2ng/mL FGF-2 的低糖 DMEM 培养基，在 37℃、5% CO₂环境培养，约 80% 汇合时传代，调整接种密度以匹配实验需求，作为 CPCs 分化能力的对照。

三谱系分化诱导：脂肪分化用高糖 DMEM 培养基(含 0.5mM IBMX、1μM 地塞米松、10μM 胰岛素、200μM 吲哚美辛)培养 14 天;内皮分化用 M199 培养基(含 2% FBS、50ng/mL VEGF)培养 14 天，每 3 天换液;神经分化分四步：24h 用含 2% B27、250μM IBMX、10ng/mL FGF-2 的培养基，后续 3 天仅加 2% B27，再 7 天加 1μM 全反式维 A 酸，最后 7 天加 2% B27+10ng/mL BDNF，共 18 天。

检测与形态分析：脂肪分化用 4% 多聚甲醛固定后油红 O 染色，ImageJ 定量染色强度;免疫荧光检测谱系标志物(脂肪：PPARγ;内皮：eNOS/VEGFR-2;神经：TUBB3)，二抗偶联过氧化物酶，DAB 显色;qPCR 检测目标基因(如脂肪的 PLIN2、内皮的 eNOS、神经的 Nestin)，以 GAPDH 归一化;Western blot 检测蛋白(如 PPARγ、TUBB3)，β-actin 为内参;ImageJ 分析细胞形态(圆度、周长 / 面积比、坚实度)，PCA 分析形态数据聚类。

统计分析：用 GraphPad Prism 9.5 软件，定量数据以 “均值 ± 标准差” 表示，两组比较用 t 检验，多组比较用 ANOVA(Bonferroni/Dunn 校正)，PCA 分析形态变量归一化后的聚类情况，p<0.05 为差异有统计学意义，所有实验独立重复至少 3 次。

实验结果

图1：CPCs 的形态与干细胞标志物表达

该图展示 CPCs 的体外培养特征与免疫表型：A 图显示 CPCs 在培养 15-21 天时形态异质，以细长形细胞为主且比例随时间增加;B 图 qPCR 结果显示，CPCs 表达 CD105(与 BMSCs 相当)、CD45、CD31、CD14(显著高于 BMSCs，分别为 26 倍、25 倍)，不表达 BMSCs 特征性标志物 CD90、CD73，且与 BMSCs 类似表达 Oct3/4、Nanog(干细胞标志物)，不表达造血标志物 CD34，证实 CPCs 为含干细胞特性的异质细胞群。

图2：CPCs 的脂肪分化

该图验证 CPCs 向脂肪细胞分化的能力：A 图油红 O 染色显示，脂肪诱导组(Adipo)细胞内出现大量红色脂质滴，对照组(CTR)无明显染色，且诱导组细胞从梭形变为球形;B 图 ImageJ 定量证实诱导组染色强度显著高于对照;C 图形态计量与 PCA 分析显示，诱导组细胞圆度更高、周长 / 面积比更低，且 PCA 聚类与对照完全分离;D 图 qPCR 显示，诱导 7-14 天，脂肪标志物 PLIN2、FABP4、FASN、CD36 mRNA 逐步上调，干细胞标志物 CD45、CD105 下调;E 图 Western blot 证实，诱导后 PPARγ、脂联素、FASN 蛋白表达显著升高，证实 CPCs 成功分化为功能脂肪细胞。

图3：BMSCs 的脂肪分化(对照)

该图作为 CPCs 脂肪分化的阳性对照：A 图油红 O 染色显示 BMSCs 脂肪诱导组脂质滴积累明显，对照无染色;B 图定量显示诱导组染色强度高;C 图形态分析与 PCA 证实诱导组形态更圆，聚类与对照分离;D 图 qPCR 显示 PPARγ、APN、FASN mRNA 在诱导后显著上调，表明 BMSCs 脂肪分化能力正常，可作为 CPCs 分化能力的参照。

图4：CPCs 的内皮分化

该图展示 CPCs 向内皮细胞分化的效果：A 图免疫荧光显示，诱导 7-14 天，CPCs 表达内皮标志物 eNOS 与 VEGFR-2，且 14 天染色强度更高;B 图 qPCR 证实，诱导后 eNOS、VEGFR-2、CD31 mRNA 显著上调，且随时间增加;C 图显示诱导组造血标志物 CD45 mRNA 显著下调， mesenchymal 标志物 CD105 无明显下降，符合内皮分化过程中谱系转换的特征，证实 CPCs 获得内皮细胞表型。

图5：BMSCs 的内皮分化(对照)

该图为 CPCs 内皮分化的对照：A 图免疫荧光显示 BMSCs 诱导 6-14 天，eNOS 表达逐步增强，14 天 VEGFR-2 呈阳性，对照无明显信号;B 图 qPCR 显示，诱导 7-14 天，CD105、eNOS、VEGFR-2、CD31 mRNA 均上调，14 天表达最高，与 CPCs 内皮分化趋势一致，进一步验证诱导体系有效，且 CPCs 分化能力与 BMSCs 相当。

图6：CPCs 的神经样细胞分化

该图验证 CPCs 向神经样细胞分化的潜力：A 图免疫荧光显示，神经诱导组(Neu)细胞 TUBB3 阳性，呈细长分支形态，对照组(CTR)为梭形且 TUBB3 阴性;B 图形态分析与 PCA 显示，诱导组周长 / 面积比更高、坚实度更低(分支更多)，PCA 聚类与对照完全分离;C 图 qPCR 显示，诱导组 CD45、CD105 下调，TUBB3、Nestin、NFL 显著上调;D 图 Western blot 证实，诱导组 TUBB3 蛋白升高、CD105 降低，表明 CPCs 成功分化为神经样细胞。

图7：BMSCs 的神经样细胞分化(对照)

该图作为 CPCs 神经分化的对照：A 图免疫荧光显示 BMSCs 神经诱导组 TUBB3 强阳性，呈神经样形态，对照为梭形;B 图形态分析与 PCA 证实诱导组形态更复杂，聚类与对照分离;C 图 qPCR 显示诱导组 CD45、CD105 下调，TUBB3、Nestin、NFL 上调;D-E 图 Western blot 显示诱导组 TUBB3 升高、CD105 降低，与 CPCs 结果一致，证实 CPCs 神经分化能力与 BMSCs 相当。

研究结论

本研究从健康供体浓缩生长因子(CGF)中分离获得 CGF 来源细胞(CPCs)，证实其表达 CD105、Oct3/4、Nanog 等干细胞标志物，且具有与骨髓间充质干细胞(BMSCs)相当的多向分化能力 —— 在特定诱导条件下可成功分化为脂肪细胞(表达 PPARγ、积累脂质)、内皮细胞(表达 eNOS、VEGFR-2)及神经样细胞(表达 TUBB3、Nestin)，分化过程中谱系特异性标志物基因与蛋白显著上调，干细胞标志物下调，形态也呈现对应谱系特征。该研究填补了 CGF 细胞除成骨外多向分化研究的空白，表明 CGF 既是生长因子缓释载体，也是自体多能干细胞库，为其在脂肪修复、血管再生、神经修复等多领域再生医学应用提供实验依据;同时研究存在局限性，供体仅为 5 名健康人，未纳入病理状态供体，且未探索软骨分化潜力，未来需扩大样本量并拓展分化谱系，进一步验证 CPCs 在临床场景中的适用性。# 浓缩生长因子来源细胞的多向分化能力研究：脂肪、内皮及神经样细胞分化潜力探索