环状 RNA 在人类胎盘老化与死胎中的作用：机制解析及筛查价值

不明原因死胎全球年发 200 万例，胎盘早衰(功能提前衰退)是核心机制之一，但具体分子通路未明。环状 RNA(circRNA)因酶解抗性在动物老化组织中积累，且能结合 DNA 形成 “circR-loop” 诱导损伤，却从未在人类胎盘研究中报道。

澳大利亚弗林德斯大学团队在《American Journal of Obstetrics and Gynecology》首次发现：7 种 circRNA 在健康老化胎盘(40-41 + 周)中积累，在不明原因死胎胎盘(23-34 周)中提前高表达，通过 circR-loop 引发 DNA 损伤与细胞衰老，且母血 15-16 周 circRNA 可预测死胎风险，为机制解析与早期预警提供新方向。

研究背景：不明原因死胎与胎盘早衰密切相关，但早衰分子机制未知;circRNA 在动物老化组织中积累并诱导基因组不稳定，其在人类胎盘及死胎中的作用尚未探索，且缺乏死胎早期筛查标志物。

实验方法：纳入 60 例健康足月胎盘(37-41 + 周)、4 例不明原因死胎胎盘(23-34 周)及 18 例母血(15-16 周)，分离滋养层干细胞(TSCs)并分化验证，通过 qPCR、DRIP-qPCR、siRNA 敲低、彗星实验等检测 circRNA 丰度、circR-loop、DNA 损伤及衰老指标。

研究结果：健康老化与死胎胎盘的 circRNA 显著积累(线性转录本无变化)，端粒缩短 40%，DNA 损伤与衰老基因表达升高;circRNA 结合 DNA 形成 circR-loop，敲低 circ_0000284 可缓解损伤与衰老;死胎组母血中 4 种 circRNA 丰度显著升高。

实验方法

1.样本收集：健康胎盘为 37-41 + 周足月胎盘(60 例，每孕周 12 例)，死胎胎盘为 4 例不明原因死胎胎盘(23/26/31/34 周，排除畸形 / 感染)，均 - 80℃保存;母血为 15-16 周外周血(12 例活产、6 例死胎)，分离血浆后 - 80℃保存，用于 circRNA 检测。

2.TSC 分离、培养与分化：从 5 例早孕期(6-8 周)胎盘分离 TSCs，用含 A83-01、EGF 的培养基在 37℃、1% O₂环境维持干性;分化为 STB 时用含 Forskolin 的培养基培养 4 代，分化为 EVT 时用含 hNRG1-β1 的培养基培养 4 代(前 6 天加 hNRG1-β1)，通过免疫细胞化学(STB 用 E - 钙粘蛋白、EVT 用 HLA-G)验证身份。

3.circRNA 检测与功能验证：胎盘组织用 TRIzol 提取总 RNA，经 RNase R 消化线性 RNA 后，用靶向反向剪接位点的发散引物 qPCR 检测 circRNA;母血用 miRNeasy 试剂盒提取 RNA;向 STB 中转染 10nM circ_0000284 特异性 siRNA 或 scramble siRNA，96 小时后检测相关指标;通过 DRIP-qPCR(抗 DNA-RNA 杂交抗体沉淀复合物)验证 circR-loop，RNase H 处理作为阴性对照。

4.衰老与 DNA 损伤检测：采用 qPCR 检测端粒与单拷贝基因比值(T/S 比值)评估端粒长度;qPCR 检测 CXCL8、CST3 等 10 个衰老标志物的表达;通过彗星实验检测尾 DNA%(每样本分析 100 个细胞)评估 DNA 损伤程度。

5.统计分析：使用 SPSS 21.0 软件，定量数据以 “均值 ± 标准差” 表示，通过 Grubbs 检验去除异常值，正态分布数据采用 ANOVA(Tukey 校正)，非正态数据采用 Kruskal-Wallis 检验，p<0.05 判定为差异有统计学意义。

实验结果

图1：胎盘 circRNA 丰度与 circR-loop 验证

该图显示 7 种 circRNA(如 circ_0009000、circ_0000284)的丰度随孕周升高，40-41 + 周健康胎盘显著高于 37 周(p<0.001)，死胎胎盘丰度与 41 + 周相当，而线性转录本无显著变化;DRIP-qPCR 证实这些 circRNA 可与胎盘 DNA 结合形成 circR-loop(RNase H 处理后信号显著降低，p<0.0001);加入 RNase H1 siRNA 后，所有胎盘的 circRNA 丰度均下降，且死胎胎盘下降更明显(与 37 周比 p=0.0094)，提示死胎胎盘内源性 RNase H1 不足。

图2：胎盘衰老与 DNA 损伤特征

该图表明死胎胎盘的端粒长度(T/S 比值 3.108±1.954)显著短于 37 周健康胎盘(5.881±2.823，p<0.05);41 + 周健康胎盘与死胎胎盘的衰老基因(如 CXCL8、CST3)表达显著高于 37 周(p<0.0001)，仅 TYROBP 在 41 + 周的表达高于死胎(p=0.0038);彗星实验显示 40 周胎盘尾 DNA% 显著高于 37/38 周(p<0.05)，41 + 周与死胎胎盘尾 DNA% 显著高于 37-40 周(p<0.0001)，死胎胎盘损伤程度是 37 周的 2.3 倍。

图3：circ_0000284 的表达部位与功能验证

该图验证 circ_0000284 仅在 TSCs 分化的 STB 中表达(E - 钙粘蛋白阳性)，且随传代(P1-P4)丰度升高(P4 是 P1 的 2.7 倍)，在 EVT(HLA-G 阳性)中未检测到;转染 circ_0000284 特异性 siRNA 后，其丰度显著降低(线性 HIPK3 无变化)，circR-loop 信号降低 79.1%，衰老基因(CXCL8、CCL3 等)表达下降，尾 DNA% 较对照减少 41.3%(p<0.0001)，而 scramble siRNA 无影响。

图4：母血 circRNA 的筛查价值

该图显示 15-16 周母血中，死胎组的 circ_0009000(p=0.0137)、circ_0036877(p=0.0002)、circ_0111277(p=0.0052)、circ_0054624(p=0.0158)丰度显著高于活产组，其余 3 种 circRNA 无差异，提示这 4 种 circRNA 可作为死胎风险的潜在筛查指标。

图5：circRNA 介导胎盘早衰的机制模型

该图提出核心机制：健康妊娠中，circRNA 随胎盘老化自然积累;死胎妊娠中，胎盘早衰导致 circRNA 提前大量积累，结合 DNA 形成 circR-loop，阻碍 RNA 聚合酶 Ⅱ 转录并引发双链断裂，激活细胞衰老与凋亡，降低胎盘功能至无法支持胎儿，最终导致死胎，且死胎胎盘内源性 RNase H1 不足可能加剧 circRNA 积累。

研究结论

circRNA 通过与胎盘 DNA 形成 circR-loop，诱导 DNA 损伤与细胞衰老，进而导致胎盘早衰并关联不明原因死胎，其中 circ_0000284 是关键功能分子(特异性表达于 STB，敲低可缓解损伤与衰老);15-16 周母血中 4 种 circRNA(circ_0009000、circ_0036877 等)可作为死胎风险的无创筛查标志物，为临床早期预警提供依据;但本研究存在死胎样本量小(4 例)、未涵盖胎盘血管瘤亚型、未分析胎儿性别差异等局限，未来需扩大样本验证，并探索 RNase H1 调控 circRNA 降解的机制，为胎盘早衰相关疾病开发干预策略。