AI 驱动图像分析探索分子涂层在人类角膜内皮细胞原代培养中的作用

人类角膜内皮细胞(hCECs)构成角膜后表面单层六边形细胞，维持角膜透明性，但无自我再生能力，角膜内皮功能障碍需角膜移植治疗，全球供体严重短缺。细胞 / 组织治疗是替代方案，但需高质量 hCECs 培养(高内皮细胞密度 ECD、低大小变异、高六边形比例)，分子涂层影响细胞粘附与分化，传统图像分析难以精准评估培养质量。

法国圣埃蒂安大学团队在《Scientific Reports》发表题为Investigating the role of molecular coating in human corneal endothelial cell primary culture using artificial intelligence-driven image analysis的研究：开发基于 Cellpose 算法的 AI 图像分析工具(调优后可精准分割 hCECs)，系统筛选 13 种分子涂层(9 种层粘连蛋白、3 种胶原)，发现 IV 型胶原(Col IV)可最优提升 hCECs 培养质量(ECD 更高、形态更接近天然)，效果优于临床常用的 iMatrix-511，为 hCECs 规模化培养提供关键方案。

研究背景：hCECs 维持角膜透明的屏障与离子泵功能，不可再生，角膜移植供体短缺推动细胞治疗发展;高质量 hCECs 培养需优化分子涂层(影响细胞粘附分化)，但传统图像分析无法精准评估形态参数，且缺乏对多种涂层的系统筛选，老年供体 hCECs 易发生内皮间质转化(EndoMT)，进一步增加培养难度。

实验方法：纳入 8 例 55-85 岁供体的 hCECs，用含 p38/TGF-β 抑制剂的培养基防 EndoMT，测试 13 种分子涂层(9 层粘连蛋白、3 胶原、无涂层对照);开发调优的 Cellpose AI 模型，评估 5 个形态参数(面积 CV、调整 CV、六边形比例 HEX、六边形质量 HEX-Q、丝形度)，建立内皮质量评分(EQS，50% 权重给 ECD、50% 给形态);用线性混合效应模型分析涂层与供体的影响。

实验结果：AI 工具可有效区分不同质量 hCECs 培养(如 EndoMT 与优质培养);8 种涂层的 ECD 显著优于对照，IV 型胶原 EQS 最高(形态与密度最优);iMatrix-511 可改善细胞形态，但效果弱于 IV 型胶原;HEX-Q 较传统 HEX 更能区分涂层差异。

实验方法

1.样本收集与伦理：hCECs 来自法国 3 个眼库的器官培养角膜(供体 55-85 岁，角膜因不符合移植标准用于研究)，伦理经法国高等教育与研究部批准(DC-2023-5458)，遵循赫尔辛基宣言;AI 调优用 15 张免疫荧光图像，验证用 4 种不同质量培养，涂层筛选用 8 例供体(每涂层 8 重复)。

2.细胞培养：消化培养基含胶原酶 A(2mg/mL)消化 Descemet 膜 16 小时，基础培养基含 8% FBS、SB203580(p38 抑制剂)、SB431542(TGF-β 抑制剂)防 EndoMT，传代时加 Y-27632(ROCK 抑制剂)促存活;hCECs 在 384 孔板(预涂不同分子)中培养至汇合， passages 4-9 用于实验。

3.免疫细胞化学与图像获取：hCECs 用甲醇固定，NCAM 抗体(膜标志物)、DAPI(核)染色，Alexa Fluor 488 二抗孵育;倒置荧光显微镜(IX81)取 x10/x40 图像，CMOS 相机(2024×2048 像素)采集，确保曝光与分辨率一致。

4.AI 驱动的分割与形态分析：用 Cellpose 算法，基于 15 张手动分割图像调优 “cyto3” 模型(4 折交叉验证，60% 训练、20% 测试 / 验证，数据增强 4 倍);Python 脚本计算 5 个形态参数(CV：面积变异系数;调整 CV：基于中位数评估主要细胞群;HEX：六边形细胞比例;HEX-Q：六边形接近完美程度;丝形度：细胞伸长率)，EQS 评分整合 ECD(50%)与 5 个形态参数(各 10%)。

5.统计分析：用 GraphPad Prism 检验数据正态性(Kolmogorov-Smirnov、Shapiro-Wilk 等)，正态数据用重复测量 ANOVA(Bonferroni 校正)，非正态用 Friedman 检验(Dunn 校正);R 软件(lme4 包)做线性混合效应模型，分析涂层(固定效应)与供体 / 重复(随机效应)对 ECD 和形态的影响，ECD 对数转换后分析，p<0.05 为显著。

实验结果

图1：Cellpose 分割与 AI 模型训练

该图展示 AI 模型的建立过程：预训练 “cyto3” 模型对 NCAM 标记的 hCECs 分割效果差(细胞边界识别不清);通过 15 张不同质量 hCECs 图像手动分割(每图 4-8 小时)，4 折交叉验证调优模型(最优 epoch=800)，调优后分割与手动分割的差异系数仅 0.034±0.010，能精准识别细胞膜与核，显著优于预训练模型，为后续形态分析奠定基础。

图2：hCECs 形态参数定义与理想 / 非理想 mosaic 对比

该图明确 5 个形态参数的意义：理想 mosaic 中，CV 与调整 CV 均为 0%、HEX=100%、HEX-Q=80%、丝形度 = 14%;非理想 mosaic 中，CV 达 108.6%、调整 CV=40%(排除异常细胞后)、HEX=60%、HEX-Q=20%、丝形度 = 89%;调整 CV 可聚焦主要细胞群，HEX-Q 评估六边形完整性，丝形度反映细胞伸长，弥补传统参数(仅 CV、HEX)的不足。

图3：AI 方法对不同质量 hCECs 培养的区分能力

该图验证 AI 工具的有效性：4 种培养质量(1. EndoMT 细胞、2. 混合群体、3. 年轻供体优质培养、4. 老年供体优质培养)的 6 个参数(ECD、HEX、HEX-Q、CV、调整 CV、丝形度)差异显著;EndoMT 培养 ECD 低、HEX 接近 0、丝形度高;年轻供体培养 ECD 最高(>2000 cells/mm²)、CV 低;老年供体优质培养 ECD 略低但形态更均一;证实 AI 可精准区分从差到优的培养质量，为涂层筛选提供可靠工具。

图4：内皮质量评分(EQS)对培养质量的评估

该图展示 EQS 的区分效果：EQS 显著高于 EndoMT(1 组)与混合群体(2 组)，年轻供体优质培养(3 组)EQS 最高(因 ECD 占比 50%)，老年供体优质培养(4 组)EQS 次之(形态更优但 ECD 略低);1 组与 2 组 EQS 无统计学差异，但视觉上 EndoMT 无六边形细胞，提示 EQS 需结合形态可视化，整体可作为培养质量的综合评估指标。

图5：不同分子涂层对 hCECs 形态的影响

该图为代表性涂层的 hCECs 形态：无涂层对照(CTRL)细胞稀疏、形态不规则;层粘连蛋白(如 B121、B332)与胶原(Col I、Col IV)涂层下细胞更密集;Col IV 涂层细胞呈均匀六边形，NCAM 染色显示膜完整性好;iMatrix-511 涂层细胞形态较规则但密度略低于 Col IV;直观体现涂层对细胞粘附与形态的改善作用，且不同涂层效果差异明显。

图6：混合模型分析涂层对 ECD、形态与 EQS 的影响

该图量化涂层效果：A 图(ECD)：8 种涂层(如 B111、Col IV)ECD 显著高于对照，Col IV ECD 比值达 1.1;B 图(形态)：HEX 无法区分涂层，HEX-Q 中 B121、B332、iMatrix-511、Col IV 显著高于对照;C 图(EQS)：仅 B332 与对照无差异，Col IV EQS 最高(比值 > 0.6)，iMatrix-511 次之;证实 Col IV 在提升 ECD 与形态完整性上最优，为最优涂层。

研究结论

本研究开发了基于 Cellpose 的 AI 图像分析工具，可精准分割 hCECs 并评估 5 个形态参数，建立的 EQS 能综合衡量培养质量;通过对 13 种分子涂层的系统筛选，发现 IV 型胶原(Col IV)可最优提升老年供体 hCECs 的培养质量(ECD 更高、形态更接近天然内皮)，效果优于临床常用的 iMatrix-511，8 种涂层的 ECD 显著优于无涂层对照;该工具与最优涂层为 hCECs 规模化培养提供关键支持，助力细胞治疗发展;但研究存在局限性，384 孔板因体积小导致孔间变异性，未检测 hCECs 的离子泵功能等生物学指标，未来需用更大培养面积验证，并关联形态与功能，进一步优化临床级 hCECs 培养方案。