博来霉素与西罗莫司抑制非消退型先天性血管瘤 CD31 + 内皮细胞增殖的研究：模型建立与药物验证

非消退型先天性血管瘤(NICH)是新生儿罕见血管异常，出生即存在且持续终身，易引发畸形、出血等并发症，但现有治疗(如普萘洛尔、手术)效果有限，核心瓶颈是缺乏稳定的体外细胞与体内动物模型。四川大学华西医院团队在《Frontiers in Cell and Developmental Biology》发表研究：从 5 例 NICH 患者组织中分离并培养 CD31 + 内皮细胞(CD31+NICHECs)，建立其体外球状体模型及裸鼠皮下移植模型，发现博来霉素(50nM 起效)与西罗莫司(10nM 起效)可抑制细胞增殖，联合用药能显著缩小裸鼠移植瘤并降低血管密度，为 NICH 治疗提供新模型与候选方案。

本研究旨在解决 NICH 研究中模型缺失的问题，探索有效治疗药物。方法：从 5 例 NICH 患者组织分离原代细胞，流式分选 CD31 + 内皮细胞，培养并鉴定其形态与标志物;构建体外球状体模型及裸鼠皮下移植模型;用 CCK-8 法筛选阿昔替尼、卡博替尼、博来霉素等 6 种药物的体外抑制效果，裸鼠瘤内注射验证最优药物及联合方案。结果：成功获得 CD31+NICHECs(占原代细胞 1.2%)，可形成球状体且裸鼠注射后成瘤(原代细胞不成瘤);博来霉素(50nM)与西罗莫司(10nM)体外抑制效果显著，联合用药使裸鼠移植瘤体积缩小最明显(血管密度降低 40%)。结论：CD31+NICHECs 模型为 NICH 机制研究与药物筛选提供工具，博来霉素 + 西罗莫司是潜在治疗方案，需进一步探索分子机制及亚型适用性。

实验方法

细胞分离与培养：NICH 组织无菌剪碎后用血管特异性 Matrigel 包被，EBM-2 培养基(含 20% FBS、双抗)培养 14 天，胰酶消化获原代细胞;用 CD31 抗体标记，流式分选 CD31+NICHECs，后续用含 10% FBS 的 EBM-2 培养基在 37℃、5% CO₂环境培养。

球状体快速培养：专用玻璃培养皿经 Sigmacoat 处理并灭菌，每皿加 10mL 培养基及 3×10⁶个 CD31+NICHECs，以 10 次 / 分钟振荡培养，EVOS 显微镜观察形态，10% 中性福尔马林固定用于免疫组化。

裸鼠皮下成瘤：6 周龄雄性裸鼠右侧大腿皮下注射 1×10⁷个 CD31+NICHECs(含 Matrigel)，20 天后处死取瘤，10% 中性福尔马林固定。

免疫组化鉴定：样本石蜡包埋切片，HE 染色观察形态;免疫组化检测 CD31(内皮标志)、CD34(血管标志)、GLUT-1(血管瘤标志)、Ki-67(增殖标志)，抗体稀释比 1:100-200。

药物效果评估：CD31+NICHECs 接种 96 孔板，12 小时后加 10nM-2μM 的阿昔替尼、卡博替尼等 6 种药物，48 小时后加 CCK-8 测 OD 值;体内实验中，裸鼠成瘤后瘤内注射博来霉素、西罗莫司及联合用药 1 周，取瘤测体积与血管密度。

统计分析：用 SPSS 21.0，定量数据以 “均值 ± 标准差” 表示，多组比较用 ANOVA，两两比较用 Dunnett 检验，p<0.05 为显著。

实验结果

图1：NICH 细胞的分离与培养

该图展示 NICH 原代细胞及 CD31 + 细胞的获取过程：A 图显示培养 7-14 天原代细胞逐渐贴壁生长;B 图 HE 染色示细胞形态，免疫组化显示原代细胞中少数 CD31+(内皮)、多数 α-SMA+(平滑肌);C 图对比原代细胞(圆形)与 CD31+NICHECs(细长形)的形态差异;D-E 图流式分选结果：CD31 + 细胞占比仅 1.2%，阴性对照无阳性信号。最终从 5 例患者中成功分离 3 株 CD31+NICHECs。

图2：CD31+NICHECs 的鉴定(球状体模型)

该图验证 CD31+NICHECs 的球状体特征：A 图示体外形成的致密球状体;B 图 HE 染色显示球状体内细胞密集排列;C-F 图免疫组化：球状体 CD31+(内皮身份)、CD34-、GLUT-1-(与 NICH 组织一致)，Ki-67 + 细胞少(低增殖活性)，证实球状体符合 NICH 细胞表型。

图3：CD31+NICHECs 裸鼠皮下成瘤

该图证实 CD31+NICHECs 的致瘤性：A 图示注射 20 天后裸鼠右侧大腿皮下肿瘤;B 图为剥离的肿瘤组织;C 图 HE 染色显示移植瘤与原 NICH 组织形态相似;D-G 图免疫组化：移植瘤 CD31+、CD34+(血管形成)，GLUT-1+、Ki-67+(高增殖，与原 NICH 组织的低增殖形成对比)，而原代 NICH 细胞注射后无肿瘤形成，说明 CD31 + 细胞是 NICH 致瘤关键亚群。

图4：CD31+NICHECs 的体外药物筛选

该图比较 6 种药物的抑制效果：A-C 图显示阿昔替尼、卡博替尼、索拉非尼需 2μM 高浓度才抑制增殖;D 图普萘洛尔 50nM 起效但浓度升高效果无显著增强;E 图西罗莫司 10nM 即起效，且随浓度升高抑制率梯度增加;F 图博来霉素 50nM 起效，高浓度抑制率增幅小;G 图联合用药(50nM 西罗莫司 + 不同浓度博来霉素)显著抑制增殖，但浓度升高无额外增益，提示存在最佳浓度窗口。

图5：裸鼠移植瘤的体内药物验证

该图验证药物体内疗效：A 图示裸鼠成瘤及给药方案;B 图剥离的各组肿瘤(对照、博来霉素、西罗莫司、联合用药);C 图 CD31 免疫组化显示各组血管密度差异;D-E 图定量结果：联合用药组肿瘤体积最小(较对照缩小 60%)，血管密度最低(较对照降低 40%)，证实联合用药的体内优势。

研究结论

本研究成功从 5 例非消退型先天性血管瘤(NICH)患者组织中分离并培养出 CD31 + 内皮细胞(CD31+NICHECs)，建立了其体外球状体模型及裸鼠皮下移植模型，明确 CD31 + 细胞是 NICH 致瘤的核心亚群(原代 NICH 细胞无致瘤性，仅 CD31+NICHECs 可在裸鼠体内成瘤)，为 NICH 的发病机制研究与药物筛选提供了稳定工具;通过体外药物筛选发现，西罗莫司(10nM 即可起效，且抑制率随浓度梯度增加)与博来霉素(50nM 起效)对 CD31+NICHECs 增殖的抑制效果最优，进一步体内实验证实二者联合用药可显著缩小裸鼠移植瘤体积(较对照组缩小 60%)并降低肿瘤血管密度(较对照组降低 40%)，是 NICH 的潜在有效治疗方案;同时，研究也存在局限性，如仅从 5 例患者中成功分离 3 株 CD31+NICHECs，样本量较小且未涵盖先天性血管瘤的快速消退型(RICH)、部分消退型(PICH)等亚型，未深入探索药物抑制 CD31+NICHECs 增殖的分子机制，且裸鼠移植瘤模型中 CD31+NICHECs 呈增殖状态，与人类 NICH 的静态状态及成熟血管结构、纤维化基质存在差异，后续需优化患者来源移植模型以更精准评估药物疗效。