双层（清洁-治愈）水凝胶中光控时空顺序释放MXenes/NO气体促进MRSA生物膜感染的糖尿病溃疡伤口愈合

基本信息

英文标题：Photo-controlled spatiotemporal sequential release of MXenes/NO gas from bilayer (clean-cure) hydrogel promotes healing of MRSA biofilm-infected diabetic ulcer wounds

中文标题：双层(清洁-治愈)水凝胶中光控时空顺序释放MXenes/NO气体促进MRSA生物膜感染的糖尿病溃疡伤口愈合

发表期刊：《Journal of Controlled Release》

影响因子：11.5

作者单位：

华侨大学生物材料与组织工程研究所、化工学院，福建省生物化工技术重点实验室(华侨大学)

作者信息：

Ying-Tong Ye, Xi Xiao, Hong-Ying Xia, Jie Li, Zhen-Zhen Gong, Ai-Zheng Chen, Shi-Bin Wang, Ranjith Kumar Kankala

研究背景

1.糖尿病溃疡伤口(DUWs)愈合缓慢，常伴有耐药菌(如MRSA)生物膜感染、持续炎症、氧化应激和血管生成受损。

2.传统单层水凝胶功能单一，难以满足伤口愈合多阶段(抗菌/抗炎→血管生成/组织重塑)的时序需求。

3.二维材料MXenes(如Ti₃C₂)具有优异的光热转换和抗菌性能;CeO₂纳米酶可清除活性氧(ROS);一氧化氮(NO)可促进血管生成和免疫调节。

4.研究创新点：本研究设计了一种双层水凝胶(GCM/Clean-GDA/Cure)，实现近红外光控下MXenes与NO的时空顺序释放，协同执行“清洁”(抗菌、抗炎)和“治愈”(促血管生成、组织再生)功能。

研究方法

1.材料制备： 通过化学刻蚀和超声剥离制备Ti₃C₂ MXene纳米片(MX NSs)，并用水热法在其表面原位生长CeO₂纳米点(CO-MX NSs)。

2.水凝胶构建： 下层GCM水凝胶由明胶-羧甲基壳聚糖包载CO-MX NSs;上层GDA水凝胶由多巴胺修饰的甲基丙烯酰化明胶(GelMA-DA)和L-精氨酸(L-Arg)组成，经405 nm蓝光交联。

3.表征分析： 使用TEM、SEM、XRD、XPS、DLS、UV-Vis、¹H NMR等对材料形貌、结构、组成进行表征。

4.性能测试： 评估水凝胶的力学性能、光热性能、抗氧化性能(DPPH⁺/ABTS⁺清除)、降解行为、Ce离子和NO释放动力学。

5.体外抗菌实验： 通过菌落计数(CFU)和结晶紫染色评价对MRSA、大肠杆菌、铜绿假单胞菌的抗菌及生物膜抑制效果。

6.生物相容性评价： 采用CCK-8、Calcein AM/PI染色、溶血实验评估对L929、HUVEC、RAW264.7细胞的毒性。

7.血管生成与抗炎实验： 通过划痕实验、成管实验评价HUVEC迁移与成管能力;通过ELISA检测RAW264.7细胞炎症因子(TNF-α, IL-6, IL-10, TGF-β1)表达。

8.体内动物实验： 建立STZ诱导的糖尿病小鼠MRSA感染全层皮肤缺损模型，分组(PBS、GCM、GCM+Laser、GDA、Bilayer、Bilayer+Laser、商用凝胶)处理，评估伤口愈合率、菌落计数、组织学(H&E、Masson、免疫组化/免疫荧光)及转录组测序分析。

研究结果：

方案1.示意图展示了(A)设计双层(GCM/Clean- GDA /Cure)水凝胶的构建方法及(B)其在促进耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)感染 DUW 愈合方面的生物医学应用。

实验结果

图1. CO-MX NSs的制备与表征

A) CO-MX NSs复合材料的合成步骤示意图。

B) CO-MX NSs复合材料的TEM及元素分布图。

C) 前体Ti₃AlC₂的SEM图像。

D) 单层/少数层Ti₃C₂ MX NSs的TEM图像。

E) CO-MX NSs复合材料的SEM图像。

F-G) Ti₃C₂ MX NSs和CO-MX NSs的DLS粒径分布。

H) Zeta电位。

I) XRD图谱。

J) UV-Vis光谱。

K) XPS全谱。

L) Ce 3d高分辨谱。

M) Ti₃C₂ MX NSs和CO-MX NSs在808 nm激光(1.5 W/cm²)照射下的光热升温曲线。

图2. 双层水凝胶的制备与表征

A) 不同组水凝胶样品的明场图像。

B) 双层凝胶附着于戴手套人手的照片。

C) 上：GCM凝胶明场图像及放大SEM图;下：GDA凝胶明场图像及放大SEM图。

D) 双层水凝胶的SEM图像。

E) 不同样品(Gel、GelMA、GelMA-DA)的¹H NMR谱图。

F) 水凝胶压缩测试明场图像(上：GDA凝胶;下：双层凝胶)。

G) 双层凝胶压缩后的循环应力-应变曲线。

H) 水凝胶流变性能随温度变化曲线。

图3. 水凝胶的光热、抗氧化、释放与溶血性能

A) 分散于水及Gel-CMC中的CO-MX NSs的光热升温曲线。

B) 掺杂不同浓度CO-MX NSs的水凝胶样品的光热升温曲线。

C) CO-MX NSs溶液在808 nm激光(1.0 W/cm²)照射下四次ON/OFF循环的升温曲线。

D) 掺杂不同浓度GCM的水凝胶样品的光热升温曲线。

E) 不同浓度CO-MX NSs溶液在808 nm激光(1.0 W/cm²)照射10分钟的红外热成像图。

F) 掺杂不同浓度CO-MX NSs的水凝胶样品在808 nm激光(1.0 W/cm²)照射10分钟的红外热成像图。

G) 光热转换效率计算曲线。

H) DPPH⁺自由基清除率。

I) ABTS⁺自由基清除率。

J) 不同样品的抗氧化实物图。

K) 下层GCM凝胶与上层GDA凝胶的体外降解曲线。

L) 双层水凝胶在20 mM葡萄糖溶液中，有无NIR(1.0 W/cm²)照射下的NO释放曲线。

M) 双层水凝胶在NIR照射下三个ON/OFF循环的可控NO释放能力。

N) 不同水凝胶样品的溶血率。

图4. 体外抗菌效能

A-C) 不同水凝胶组处理大肠杆菌、铜绿假单胞菌和MRSA后的代表性琼脂平板照片。

D-F) 对应的菌落计数(CFU)。

G) 不同水凝胶组处理MRSA生物膜后的结晶紫染色及抑制率。

H) MRSA和铜绿假单胞菌经不同处理后的代表性SEM图像(比例尺：5 μm)及放大图(比例尺：1 μm)。

图5. 生物相容性、抗氧化、促血管生成与抗炎效果

A-C) L929、HUVEC和RAW264.7细胞经CCK-8测定的细胞活力。

D) L929细胞与不同水凝胶共孵育24小时后的Calcein AM/PI染色图像。

E) DCFH-DA染色显示L929细胞内ROS水平。

F) HUVEC划痕实验显微镜图像。

G) HUVEC迁移能力的定量分析。

H-L) ELISA检测炎症因子(IL-10、TGF-β1、IL-6、TNF-α)及CD86表达水平。

M) Griess法检测不同处理后NO含量。

N) HUVEC成管实验图像(6小时)。

O) 成管实验中网格数和节点数的定量分析。

图6. 体内伤口愈合评估

A) MRSA感染糖尿病小鼠模型构建及治疗时间线。

B) 建模期间小鼠血糖水平。

C) 建模期间小鼠体重曲线。

D) 不同处理后伤口在不同天的代表性照片。

E) 第0、1、3、6、9、12天伤口痕迹图。

F) 不同组伤口大小的定量分析。

G) 不同治疗组感染伤口分离菌落的LB琼脂平板图。

H) PBS组与水凝胶组伤口部位在808 nm NIR照射(1.0 W/cm²)下的红外热成像图。

I) 琼脂平板培养后伤口部位菌落的定量分析。

图7. 组织学分析与皮下血流灌注

A) 第14天收集的伤口皮肤组织的H&E染色。

B) Masson染色。

C) 第13天不同治疗后小鼠皮下血管灌注水平。

D) 表皮厚度定量分析。

E) 胶原面积比定量分析。

F) 血流灌注量定量分析。

图8. 免疫组化与免疫荧光分析

A) IL-10免疫组化染色。

B) TNF-α免疫组化染色。

C) CD31免疫组化染色。

D-E) 伤口组织中F4/80(绿)和CD163(红)的免疫荧光图像(第7天和第14天)。

F-H) IL-10、TNF-α、CD31表达的统计分析。

I, K) 第7天和第14天CD163与F4/80的统计分析。

J) 双层水凝胶促进MRSA感染糖尿病伤口愈合的示意图。

图9. 转录组测序分析

A) 对照组与双层凝胶处理组转录组谱的PCA分析。

B) 火山图显示差异表达基因。

C) 两组差异表达基因的层次聚类热图。

D) GO分析显示显著富集的生物过程。

E) GO富集分析条形图。

F-G) GSEA分析显示“上皮再形成加速”和“抗炎”相关基因集在伤口组织中的富集情况。

研究结论

1.成功构建时序响应型双层水凝胶： 下层GCM(清洁层)包载CO-MX NSs，实现NIR触发的光热抗菌、ROS清除和抗炎;上层GDA(治愈层)负载L-Arg，在ROS和光热作用下原位释放NO，促进血管生成和组织重塑。

2.协同促进伤口愈合： 该水凝胶在体外展现出优异的抗菌、抗氧化、促血管生成和抗炎(促进M2巨噬细胞极化)性能。

3.显著加速糖尿病感染伤口愈合： 体内实验表明，“Bilayer + Laser”组能显著促进上皮再生、胶原沉积、新生血管形成，伤口愈合率达97.74%，并有效调节伤口微环境的免疫反应。

4.分子机制阐明： 转录组分析证实，该治疗激活了再生相关通路，抑制了过度炎症和代谢应激信号，验证了“清洁-治愈”的时序调控模式。

5.临床转化潜力： 该智能水凝胶平台具有时空精准性、协同疗效和生物适应性，为治疗难愈性糖尿病伤口提供了有前景的新策略。