报告基因假阳性预警！查尔酮对 FLuc 的抑制竟依赖 A/B 环取代模式

荧光素酶报告基因系统是一种基于荧光素酶催化底物氧化反应产生生物发光的检测技术，广泛应用于细胞生物学研究。其中，萤火虫荧光素酶(firefly luciferase, Fluc)因其高灵敏度、宽线性检测范围(约7~8个数量级)以及较短的半衰期(在哺乳动物细胞中约为3小时，在植物细胞中约为3.5小时)而成为最常用的报告基因。其发光信号强度在酶浓度为10⁻¹⁶ mol/L至10⁻⁸ mol/L的范围内与酶活性呈线性关系，并且在理想条件下可检测到低至10⁻²⁰ mol/L的荧光素酶活性。此外，荧光素酶报告基因系统具有非放射性、检测快速、灵敏度高(比氯霉素乙酰转移酶CAT高100倍)等优点，特别适用于高通量筛选和活细胞检测。通过将荧光素酶报告基因载体转染至宿主细胞后，可利用荧光素酶检测系统灵敏且便捷地监测基因表达水平，已成为细胞生物学研究中的重要工具。

基本信息

英文标题：Chalcones inhibit firefly bioluminescence dependent on A and B-ring substitution pattern – a structure-activity study combined with molecular docking

中文标题：查尔酮对萤火虫荧光素酶的抑制依赖 A 环和 B 环取代模式 —— 结合分子对接的构效关系研究

发表期刊：《Journal of Enzyme Inhibition and Medicinal Chemistry》

影响因子：5.4

作者单位：

1.Organic-analytical Chemistry, Weihenstephan-Triesdorf University of Applied Sciences, Straubing, Germany

2.TUM Campus Straubing for Biotechnology and Sustainability, Technical University of Munich, Straubing, Germany

作者信息：

Corinna Urmann,Michael Kirchner

研究背景

查尔酮是植物中广泛存在的特权结构，具有抗炎、抗癌等多种生物活性，部分吡喃查尔酮还表现出神经发生和神经保护作用。萤火虫荧光素酶(FLuc)报告基因 assay 因灵敏度高、操作简便，常被用于量化生物活性，但 FLuc 易被化合物非特异性抑制，导致假阳性结果。已有研究表明查尔酮可能抑制 FLuc，但 A 环和 B 环取代模式对抑制活性的影响尚不明确。本研究合成 20 种不同取代模式的吡喃查尔酮，探究其对 FLuc 的抑制作用及构效关系，为使用 FLuc 报告基因 assay 研究查尔酮类化合物时避免假阳性提供参考。

研究方法

合成 20 种具有不同 A 环(杂原子、取代基团)和 B 环(羟基、氨基、卤代等)取代模式的吡喃查尔酮，通过多步反应构建 A 环(含氧 / 氮 / 硫杂原子的色原酮类结构)，再与相应醛类经羟醛缩合得到目标化合物。检测指标包括：1)FLuc 抑制实验：10μM 浓度下测定化合物对重组 FLuc 的抑制率;2)IC₅₀测定：通过浓度梯度(13nM-300μM)拟合量效曲线，计算半数抑制浓度;3)分子对接：使用 AutoDock Vina 将代表性化合物对接至 FLuc 活性口袋(PDB: 3IES)，分析结合能和相互作用模式;4)结构表征：通过 NMR、ESI-HRMS 验证化合物结构。

实验结果

图 1：黄腐酚 C 与化合物 2 的 FLuc 抑制对比

天然神经活性吡喃查尔酮黄腐酚 C(1)在 10μM 浓度下对 FLuc 无抑制作用;而 A 环无额外取代基的简化衍生物化合物 2，在相同浓度下抑制率达 30%(图 1)，提示 A 环取代模式可能影响抑制活性。

图 2：20 种吡喃查尔酮的结构特征

化合物均含 2,2 - 二甲基色原酮类 A 环(部分含氮 / 硫杂原子)，B 环取代基包括羟基、甲氧基、氨基、氯、三氟甲基等，涵盖单取代、双取代等不同模式(图 2)，为构效关系分析提供多样化模型。

图 3：10μM 浓度下的 FLuc 抑制率

抑制活性差异显著：A 环无额外取代基的化合物 2 抑制率 32%，A 环含氮杂原子的化合物 6 抑制率 18%，含硫杂原子的化合物 7 抑制率 < 10%(A 环影响);B 环为氢原子的化合物 14 抑制率最高(≈90%)，含三氟甲基 / 氯等吸电子基的化合物 12、13 抑制率接近 0(B 环影响);B 环邻 / 间位二羟基取代的化合物 18 抑制率≈85%，对位二羟基取代的化合物 19、20 抑制率显著降低(图 3)。

图 4：FLuc 抑制的 IC₅₀值

抑制率 > 10% 的化合物 IC₅₀范围为 7.82-92.99μM：化合物 14(B 环无取代)IC₅₀最低(7.82μM)，化合物 18(B 环 2,3 - 二羟基)次之(<10μM);化合物 2(B 环 4 - 羟基)IC₅₀≈35μM，化合物 6(A 环含氮)IC₅₀≈93μM(图 4)，与抑制率结果一致。

图 5：分子对接分析

化合物 1(无抑制活性)因 A 环甲氧基和羟基阻碍，难以深入 FLuc 活性口袋;化合物 2(A 环无取代)可通过 B 环与 ALA348 形成疏水相互作用，结合能为 - 7.699~-9.902 kcal/mol;化合物 14(最高活性)通过 A 环与 ARG218 形成氢键，B 环与 GLY246 形成 π-π 堆积，结合能低至 - 10.422 kcal/mol;化合物 18(高活性)通过 B 环羟基与 THR346、GLY246 形成氢键稳定结合(图 5A-C)，从分子层面解释了构效关系。

研究结论

本研究明确吡喃查尔酮对 FLuc 的抑制活性依赖 A 环和 B 环取代模式，核心结论如下：1)A 环为无额外取代的氧杂色原酮结构时抑制活性最强，氮 / 硫杂原子取代会削弱活性;2)B 环取代基影响显著：氢原子 > 邻 / 间位二羟基 > 4 - 羟基 > 甲氧基 / 氨基 > 吸电子基(氯 / 三氟甲基);3)抑制活性 IC₅₀为 7.82-92.99μM，与查尔酮类化合物常用实验浓度重叠，易导致 FLuc 报告基因 assay 假阳性;4)分子对接证实，化合物通过氢键、疏水作用结合 FLuc 活性口袋，与 D - 荧光素竞争结合位点或形成多底物加合物抑制剂。研究提醒，使用 FLuc 报告基因研究查尔酮类化合物时需警惕非特异性抑制，建议结合免疫染色等替代方法验证结果。