miR-5787 靶向 TLR4/NF-κB 通路守护脑血管健康

Reporter THP1 Cell Line 细胞系是以 THP-1 为工具细胞，采用慢病毒感染的方式，构建稳定表达报告基因的细胞系，可用于检测信号通路转导。在被PMA、INF-α等刺激后，目标信号通路被激活，会启动下游特定基因的表达，这个表达过程会同时带动“报告基因”的表达。通过检测报告基因的信号强度，可以间接、定量、灵敏地衡量该信号通路的激活程度。

THP-1细胞本身来源于人单核细胞，可以分化为巨噬细胞样细胞，是研究先天免疫的经典模型。报告基因株的建立使其功能更强大。THP-1报告基因株是免疫学、炎症性疾病、药物研发等领域不可或缺的强大工具。它可以将一个复杂的、内在的生物学过程(信号通路激活/基因表达)转变为一个易于检测、可定量的物理信号(光或荧光)。这使得研究人员能够高通量地筛选药物，精确地量化免疫反应强度，直观地研究信号通路机制。

基本信息

英文标题：MiR‑5787 Attenuates Macrophages‑Mediated Inflammation by Targeting TLR4/NF‑κB in Ischemic Cerebral Infarction

中文标题：MiR-5787 通过靶向 TLR4/NF-κB 减轻缺血性脑梗死中巨噬细胞介导的炎症反应

发表期刊：《NeuroMolecular Medicine》

影响因子：3.9

作者单位：

1. Department of Neurology, Affiliated Kunshan Hospital of Jiangsu University, Suzhou, Jiangsu 215300, People’s Republic of China;

2. Department of Neurosurgery, Affiliated Kunshan Hospital of Jiangsu University, Suzhou, Jiangsu 215300, People’s Republic of China;

3. 91 Qianjin West Road, Kunshan City, Suzhou, China

作者信息：

Zhicheng Bao、Shuguang Zhang

研究背景

缺血性脑梗死是一种常见的脑血管疾病，活化的巨噬细胞、血管内皮细胞、自然杀伤细胞及金属蛋白酶、白细胞介素(ILs)、肿瘤坏死因子 -α(TNF-α)等多种炎症介质在其发病机制中发挥关键作用，高血压、压力、脑自主调节中枢受损等与疾病发生相关，但病因仍未完全明确，亟需寻找早期诊断生物标志物和靶向治疗方案。非编码 RNA(尤其是微小 RNA，miRNA)在缺血性脑梗死的发病机制中具有重要作用，部分可作为诊断或预后因子，miR-5787 是新发现的在缺血性脑梗死患者中异常表达的 miRNA，但其在该病中的具体作用及潜在分子机制尚未明确，因此本研究旨在阐明 miR-5787 在缺血性脑梗死发病中的作用及相关分子机制。

研究方法

本研究纳入 62 例缺血性脑梗死患者和 49 例健康对照者，经医院伦理委员会批准且所有受试者签署知情同意书后，采集新鲜全血并加入人淋巴细胞分离液，离心分离外周血单个核细胞(PBMCs)和血清样本，于 - 80℃保存备用;将 THP-1 细胞培养在含 10% 胎牛血清、青霉素和链霉素的 RPMI 1640 培养基中，经佛波醇 - 12 - 肉豆蔻酸 - 13 - 乙酸酯(PMA)刺激 48 小时分化为巨噬细胞样细胞，无血清培养 12 小时后通过慢病毒联合聚凝胺试剂转染细胞;采用 Trizol 试剂提取 RNA，经逆转录合成 cDNA 后，用 SYBR Green Mastermix 试剂盒进行实时荧光定量 PCR(Real-Time PCR)检测 TLR4、IL-6、TNF-α 等基因表达(以 GAPDH 为内参);通过酶联免疫吸附试验(ELISA)检测细胞培养上清液中 IL-6 和 TNF-α 的蛋白水平;利用 RIPA 缓冲液提取细胞总蛋白，经 Bradford 法定量后，通过蛋白质印迹法(Western Blot)检测 TLR4、p-NF-κB、β-actin 等蛋白表达;采用细胞计数试剂盒(CCK-8)检测 24h、48h、72h 时细胞增殖情况，Transwell 实验检测细胞迁移能力;构建含 TLR4 3' 非编码区(UTR)野生型(WT)和突变型(MT)结合位点的 PGL3 Basic 载体，转染 THP-1 细胞后进行荧光素酶报告基因实验验证靶基因;经 LPS 激活细胞后，通过免疫荧光检测 p-NF-κB 抗体孵育细胞中 NF-κB 的磷酸化和活化情况;采用独立样本 t 检验或单因素方差分析进行统计分析，以 P<0.05 为差异有统计学意义。

实验结果

图 1：miR-5787 与缺血性脑梗死中 IL-6 和 TNF-α 的相关性与健康对照者相比，缺血性脑梗死患者 PBMCs 中 miR-5787 的表达显著降低，而 IL-6 和 TNF-α 的 mRNA 及血清蛋白水平均明显升高;相关性分析显示，miR-5787 的表达分别与 IL-6、TNF-α 呈负相关(r² 分别为 0.332、0.306，均 P<0.001)，由于 TNF-α 和 IL-6 是巨噬细胞中经典的炎症相关细胞因子，且在缺血性脑梗死发病机制中起关键作用，提示 miR-5787 可能通过调控巨噬细胞介导的炎症参与缺血性脑梗死的发生发展。

图 2：TLR4 是 miR-5787 的靶基因缺血性脑梗死患者 PBMCs 中 TLR4 的 mRNA 表达较健康对照者显著升高，且 miR-5787 与 TLR4 的表达呈负相关(r²=0.416，P<0.01);TargetScan 和 miRBase 数据库筛选发现，miR-5787 可识别 TLR4 3'UTR 的 6124-6130 位点;在过表达 miR-5787 的巨噬细胞样细胞中，TLR4 的 mRNA 和蛋白水平均显著降低，荧光素酶报告基因实验证实 miR-5787 可靶向结合 TLR4，表明 TLR4 是 miR-5787 的直接靶基因，miR-5787 可能通过调控 TLR4 介导的巨噬细胞炎症参与缺血性脑梗死。

图 3：miR-5787 抑制巨噬细胞的增殖和迁移CCK-8 实验结果显示，过表达 miR-5787 可显著抑制 PMA 诱导的巨噬细胞样细胞增殖，而通过 lv-miR-5787-shRNA 敲低 miR-5787 后，该抑制效应被逆转;Transwell 实验表明，与对照组相比，过表达 miR-5787 的巨噬细胞迁移能力明显受到抑制，而敲低 miR-5787 则可增强巨噬细胞的迁移能力，说明 miR-5787 对巨噬细胞样 THP-1 细胞的增殖和迁移具有显著抑制作用。

图 4：miR-5787 通过 NF-κB 抑制 LPS 诱导的炎症因子产生LPS 刺激可显著升高巨噬细胞中 IL-6 和 TNF-α 的 mRNA 及细胞培养上清液中蛋白水平;而在过表达 miR-5787 的巨噬细胞中，即使经 LPS 诱导，IL-6 和 TNF-α 的 mRNA 及蛋白表达也均显著降低，提示 miR-5787 可通过 NF-κB 信号通路抑制 LPS 诱导的炎症因子生成。

图 5：miR-5787 依赖 NF-κB 减轻巨噬细胞中的炎症反应Western Blot 结果显示，LPS 刺激可激活 THP-1 细胞中 NF-κB 的磷酸化，而过表达 miR-5787 则可显著抑制 LPS 诱导的 NF-κB 磷酸化(P<0.001);免疫荧光实验进一步证实，与对照组相比，Lv-control-LPS 组的荧光强度显著增强，而过表达 miR-5787 且经 LPS 刺激组的荧光强度明显降低，表明 miR-5787 可通过 NF-κB 依赖性信号转导抑制巨噬细胞中 TLR4 介导的炎症反应。

研究结论

本研究首次阐明 miR-5787 在缺血性脑梗死发病机制中的关键作用，其在缺血性脑梗死患者 PBMCs 中表达下调，通过靶向 TLR4/NF-κB 信号通路，抑制巨噬细胞的增殖、迁移及功能，下调 TLR4 的表达，进而抑制 NF-κB 的磷酸化和活化，减少 IL-6、TNF-α 等 NF-κB 依赖性炎症因子的产生，最终减轻 TLR4 介导的巨噬细胞炎症反应，发挥对脑损伤的保护作用;该研究表明 miR-5787 不仅可能作为缺血性脑梗死早期诊断的潜在生物标志物，还为该病的靶向治疗提供了新的候选靶点，未来需进一步研究 TLR4 下游信号通路中参与缺血性脑梗死的其他关键节点，以更深入揭示该病的发病机制并探索更多有效的生物标志物和治疗策略。