乙肝治疗新突破！双靶点激动剂 INT-767 精准抑制 HBV 感染

乙肝病毒(HBV)感染是全球主要公共卫生问题之一，有超过2.5亿人慢性感染HBV。而其中有超三分之一的人口集中在我国，人数接近1亿人。NTCP工具细胞，特别是外源表达NTCP的肝癌细胞系如HepG2-NTCP和Huh7-NTCP，因其易操作、短周期、重现性佳的特点，在乙肝病毒(HBV)研究中扮演着至关重要的角色。这些细胞模型能够有效模拟HBV的感染过程，为研究HBV的生命周期、宿主限制因子、病毒复制以及药物筛选提供了一个强大而便捷的体外平台。它们不仅有助于揭示HBV感染的分子机制，如DDX3作为宿主限制因子阻碍cccDNA转录，GPC5作为附着因子在感染入胞过程中的作用，还能通过直接与NTCP相互作用或下调NTCP表达来筛选和验证抗病毒药物的活性，例如环孢菌素A及其衍生物、雷帕霉素及其衍生物等。此外，这些工具细胞还促进了对HBV宿主特异性分子的发现，为发展支持HBV感染的小动物模型提供了可能，这对于乙肝相关研究和药物开发具有重大意义。

基本信息

英文标题：Dual Agonist of Farnesoid X Receptor and G Protein-coupled Receptor TGR5 Inhibits Hepatitis B Virus Infection in Vitro and in Vivo

中文标题：法尼醇 X 受体(FXR)与 G 蛋白偶联受体 TGR5 双激动剂在体外和体内抑制乙型肝炎病毒感染

发表期刊：《Hepatology》

影响因子：15.8

作者单位：

1.Department of Gastroenterology, Aichi Medical University School of Medicine, Nagakute, Japan;

2.Department of Virology II, National Institute of Infectious Diseases, Tokyo, Japan;

3.Faculty of Pharmaceutical Sciences, Hiroshima International University, Kure, Japan;

4.Department of Molecular Target Medicine Screening, Aichi Medical University School of Medicine, Nagakute, Japan

作者信息：

Kiyoaki Ito1*(通讯作者)、Akinori Okumura、Junko S. Takeuchi、Koichi Watashi

研究背景

慢性乙型肝炎病毒(HBV)感染是全球主要健康问题，全球超 2.4 亿人受影响，且面临肝硬化、肝衰竭和肝癌风险。目前一线治疗药物为核苷(酸)类似物(NAs)和干扰素(IFNs)，但无法根治，需终身用药，且难以有效降低乙肝表面抗原(HBsAg)水平，HBsAg 清除率极低。抑制 HBV 进入肝细胞是防治急慢性感染的新策略，牛磺胆酸钠共转运多肽(NTCP)已被证实为 HBV 受体，多种化合物可通过抑制 NTCP 阻断 HBV 进入。法尼醇 X 受体(FXR)激活可通过诱导小异源二聚体伙伴(SHP)下调 NTCP 表达，因此推测 FXR 激动剂(如胆汁酸衍生物)可能具有抗 HBV 潜力。本研究旨在探讨多种胆汁酸衍生物(包括 FXR/TGR5 双激动剂 INT-767、FXR 激动剂奥贝胆酸(OCA)、TGR5 激动剂 INT-777)及其他 NTCP 抑制剂的抗 HBV 作用及机制。

研究方法

本研究采用 HepG2-hNTCP-C4、HepG2.2.15.7、Hep38.7-Tet 细胞及人源化肝脏 uPA/SCID 嵌合小鼠来源的 PXB 细胞，按相应标准培养;所用化合物包括 OCA、INT-767、INT-777(由 Intercept Pharmaceuticals 提供或商业采购)及环孢素 A(CsA)、厄贝沙坦、GW4064 等对照药物。体外实验中，HepG2-hNTCP-C4 细胞和 PXB 细胞经化合物预处理 2 小时后，感染 HBV(基因型 D 或 C)，培养后收集上清液和细胞，通过化学发光酶免疫分析检测 HBsAg、HBeAg 水平，实时荧光定量 PCR 检测 HBV DNA 和细胞内共价闭合环状 DNA(cccDNA)，免疫荧光检测乙肝核心抗原(HBcAg)，Western Blot 检测相关蛋白表达;体内实验将 9 只人源化肝脏嵌合小鼠分为对照组、A 组、B 组，尾静脉注射 HBV 后，从第 3 天开始口服给予载体或不同剂量 INT-767 至第 56 天，定期采集血清检测病毒标志物，处死小鼠后检测肝内 cccDNA。通过荧光标记 preS1 肽探针评估化合物对 preS1 与 NTCP 结合的影响，采用超滤法验证 INT-767 的作用靶点;统计分析采用 Student t 检验(两组)或单因素方差分析结合 Dunnett/Tukey 检验(多组)，以 P<0.05 为差异有统计学意义，所有实验重复 3 次。

实验结果

图 1：NTCP 抑制剂对 HepG2-hNTCP-C4 细胞中 HBsAg、HBV DNA 和 cccDNA 的影响HepG2-hNTCP-C4 细胞经化合物预处理并感染 HBV 后，4μM CsA 可降低上清液中 HBsAg、HBV DNA 及细胞内 cccDNA 水平;厄贝沙坦、GW4064、OCA、INT-777 均能剂量依赖性降低 HBsAg 水平;INT-767 抑制效果最显著，分别降低 92.9% 的 HBsAg、83.6% 的 HBV DNA 和 87.7% 的 cccDNA，且所有化合物均不影响内参基因 ACTB 的表达，无明显细胞毒性相关的基因表达异常。

图 2：INT-767 抑制 HBV 感染的剂量效应及细胞毒性PXB 细胞中，INT-767 对 HBsAg、HBV DNA、HBeAg 的半数抑制浓度(IC50)分别为 0.15μM、0.12μM、0.77μM;半数细胞毒性浓度(CC50)为 682μM，对 HBsAg、HBeAg、HBV DNA 的选择性指数(CC50/IC50)分别达 4547、886、5683，显示出高选择性和低细胞毒性。

图 3：INT-767 降低 HepG2-hNTCP-C4 细胞中 HBcAg 的表达免疫荧光结果显示，20μM CsA 可明显降低 HBcAg 水平;OCA 和 INT-777 呈弱剂量依赖性降低 HBcAg;INT-767 则呈强剂量依赖性抑制，在 1.1μM、3.3μM、10μM、30μM 浓度下均能显著减少 HBcAg 阳性细胞数量，进一步证实其抗 HBV 感染作用。

图 4：INT-767 在人源化肝脏嵌合(PXB)小鼠中抑制 HBV 感染对照组小鼠 HBsAg、HBeAg 从第 36 天开始快速升高;A 组(20mg/kg 起始，第 22 天降至 10mg/kg)1 只小鼠第 43 天检测到低滴度 HBsAg 和 HBeAg，其余 2 只病毒标志物初始升高明显延迟，HBV DNA 显著降低;B 组(40mg/kg 起始，第 8 天降至 20mg/kg，第 21 天停药)所有小鼠 HBsAg、HBeAg 初始升高显著延迟，第 57 天仅检测到极低滴度，给药期间 HBV DNA 被显著抑制，停药后略有回升;两组小鼠肝内 cccDNA 水平均低于对照组，证实 INT-767 在体内的抗 HBV 效果。

图 5：天然胆汁酸与胆汁酸衍生物对 preS1-NTCP 结合的抑制作用天然胆汁酸中，鹅去氧胆酸(CDCA)、石胆酸(LCA)等可轻微抑制 preS1 与 NTCP 的结合，但效果较弱;OCA 和 INT-777 对该结合的抑制作用较弱，而 INT-767 的抑制效果显著强于所有天然胆汁酸及其他胆汁酸衍生物，提示其在阻断 HBV 进入靶点结合环节的优势。

图 6：INT-767 通过靶向 HBV 颗粒抑制感染超滤实验显示，INT-767 预处理的 preS1 肽或 HBV 颗粒，在去除游离化合物后仍能强烈抑制 preS1 与 NTCP 的结合及 HBV 感染，效果显著强于 INT-767 预处理宿主细胞的方式;与已知靶向 HBV 颗粒的进入抑制剂原花青素(PAC)相比，INT-767 的抑制作用更强，证实 INT-767 优先结合 HBV 颗粒而非肝细胞上的 NTCP。

图 7：胆汁酸衍生物对 FXR 和 TGR5 下游信号通路的影响PXB 细胞中，OCA 和 INT-767 均能显著降低 CYP7A1、CYP27A1、APOA1 等基因表达，升高 SHP 和 BSEP 表达;INT-767 诱导的 SHP 和 BSEP 表达水平显著高于 OCA，且对 CYP8B1 的调控与 OCA 相反(INT-767 升高，OCA 降低);OCA、INT-767、INT-777 均能降低 NTCP 表达，其中 OCA 的抑制作用强于 INT-767;三者均不影响 SREBP1c 和 TGR5 的表达，提示其通过调控 FXR 下游信号参与抗 HBV 过程。

图 8：胆汁酸代谢与 FXR 下游信号通路示意图图示分别展示了正常状态(A)、持续 HBV 感染状态(B)及 FXR/TGR5 双激动剂(INT-767)给药后(C)的通路变化。正常状态下，FXR 激活通过 SHP 调控胆汁酸代谢相关基因;HBV 感染会改变胆汁酸代谢相关基因表达;INT-767 给药后，通过激活 FXR/TGR5 双受体，一方面阻断 HBV 与 NTCP 结合，另一方面调控下游信号影响 HBV 感染后步骤，发挥双重抗 HBV 作用。

研究结论

本研究系统探讨了多种胆汁酸衍生物及 NTCP 抑制剂的抗 HBV 作用，发现 FXR/TGR5 双激动剂 INT-767 在体外(HepG2-hNTCP-C4 细胞、PXB 细胞)和体内(人源化肝脏嵌合小鼠)均表现出强效抗 HBV 活性，其机制包括作为进入抑制剂优先靶向 HBV 颗粒、阻断 preS1 与 NTCP 结合，以及刺激 FXR 下游信号通路影响 HBV 感染后步骤(如 cccDNA 形成、病毒转录)，且具有高选择性和低细胞毒性。相比之下，OCA(FXR 激动剂)、INT-777(TGR5 激动剂)及天然胆汁酸的抗 HBV 效果较弱。研究证实 INT-767 是极具潜力的新型抗 HBV 候选药物，可为慢性乙肝的治疗提供新方向，未来需进一步明确其作用的精确分子机制，以推动相关药物的研发。