PEG 化 ATP 非依赖性荧光素酶底物用于非侵入性高灵敏度高速生物发光成像

在生物医学研究和药物开发领域，生物发光成像技术因其高信噪比而被广泛应用于细胞测定和动物成像研究。然而，传统的荧光素酶种类有限，限制了同时成像多个分子和细胞事件的能力。为了突破这一限制，科学家们开发了一种新型的ATP非依赖性荧光素酶——NanoLuc(NL)，它源自深海虾Oplophorus gracilirostris，并经过工程改造以增强蛋白质稳定性。NanoLuc作为一种小型(19 kDa)、高亮度的荧光素酶，其亮度是传统萤火虫或海肾荧光素酶的100倍，并且使用furimazine作为底物产生明亮的辉光型发光。NanoLuc的意义在于其为双报告基因生物发光分子成像提供了新的可能。它不仅可以在活体小鼠的表层和深层组织中成像，而且其生物发光随时间的变化可以用来定量肿瘤生长，甚至在少量血清中也能检测到分泌的NL。此外，NanoLuc与萤火虫荧光素酶的结合使用，为在完整细胞和活体小鼠中定量TGF-β信号传导的两个关键步骤提供了一种新型双荧光素酶成像策略，从而在正常生理、疾病和药物开发中扩展了信号转导的成像能力。NanoLuc的作用不仅体现在其高灵敏度和高稳定性上，它还具有更小的尺寸，这使得在标记细胞和蛋白质时对样本的侵入性更小，有助于保持细胞或组织的天然状态。NanoLuc的快速反应、低背景发光和多样灵活等特点，使其在生物学和医学研究中具有广泛的应用前景。因此，NanoLuc作为一种新的报告基因，不仅增强了我们对生物过程的理解和疾病机理的研究，而且在开发潜在治疗方法和疗法方面发挥了重要作用。

基本信息

英文标题：PEGylated ATP-Independent Luciferins for Noninvasive High-Sensitivity High-Speed Bioluminescence Imaging

中文标题：PEG 化 ATP 非依赖性荧光素酶底物用于非侵入性高灵敏度高速生物发光成像

发表期刊：《ACS Chemical Biology》

影响因子：3.8

作者单位：

1.Department of Molecular Physiology and Biological Physics, University of Virginia School of Medicine, Charlottesville, Virginia 22908, United States

2.Center for Membrane and Cell Physiology, University of Virginia School of Medicine, Charlottesville, Virginia 22908, United States

3.The UVA Comprehensive Cancer Center, University of Virginia, Charlottesville, Virginia 22908, United States

作者信息：

Xiaodong Tian，Yiyu Zhang;通讯作者(Hui-Wang Ai：huiwang.ai@virginia.edu)

研究背景

生发光成像(BLI)是无创动物研究的核心工具，NanoLuc 等 ATP 非依赖性荧光素酶因光子产量高、酶稳定性强备受关注，但存在关键瓶颈：底物(如 DTZ、Fz)水溶性差，需依赖有毒有机助溶剂;易被氧气自氧化，操作复杂且结果不稳定;血脑屏障穿透不足，限制脑部成像应用。本研究通过聚乙二醇(PEG)修饰技术，开发系列笼状荧光素酶底物(sDTZ、sFz、sCFz)，同步提升水溶性、抗自氧化能力，解决现有底物缺陷，实现高灵敏度、高速 BLI，为深层组织及脑部动态过程研究提供工具。

研究方法

通过缩合反应将不同分子量 PEG(2k、5k、10k)与 DTZ、Fz、CFz 的 C3 羰基结合，合成 PEG 化底物(sDTZ、sFz、sCFz)。检测核心指标：1)理化性质：水溶性(生理盐水 / 血清中饱和浓度)、自氧化抗性(不同储存条件下生物发光活性残留);2)体内成像：通过 AAV 介导在小鼠海马(hSyn 启动子)或肝脏(TBG 启动子)表达荧光素酶(BREP、Antares、Akaluc)，尾静脉注射底物后，用 EMCCD 相机采集生物发光信号，量化峰值强度和积分强度;3)毒性评估：连续 5 天注射 25mM sDTZ 后，H&E 染色检测主要器官毒性;4)高速成像：对自由活动小鼠交替采集明场和生物发光图像(15ms 曝光)，验证动态追踪能力。

实验结果

图 1：sDTZ 的合成与脑部成像效果

PEG10k 修饰的 DTZ(sDTZ)水溶性达 25mM(生理盐水)，是未修饰 DTZ(<0.5mM)的 50 倍以上(图 1A、B)。脑部表达 BREP 荧光素酶的小鼠中，25mM sDTZ(生理盐水溶解)的峰值发光强度比饱和 DTZ(生理盐水)高 260 倍，比 ETZ(HPCD/PEG 助溶)高 3.2 倍;15 分钟积分强度分别高 88 倍和 6 倍(图 1C-E)，且无需有毒助溶剂。

图 2：sDTZ 的肝脏成像效果

肝脏表达 BREP 的小鼠中，sDTZ 发光强度随浓度升高而增强，25mM sDTZ 的峰值强度比饱和 DTZ 高近 1000 倍，积分强度高 482 倍(图 2A-C)，证实 PEG 化修饰的灵敏度提升效果适用于非脑部组织。

图 3：sFz 与 sCFz 的脑部成像验证

PEG 化修饰扩展至 Fz 和 CFz，合成 sFz、sCFz(25mM 水溶性)，抗自氧化能力显著提升(图 S3)。脑部表达 Antares 荧光素酶的小鼠中，sCFz 的峰值强度比饱和 CFz(生理盐水)高 179 倍，比 CFz(HPCD/PEG 助溶)高 27 倍;sCFz 亮度比 sFz 高 5-6 倍，契合 CFz 本身的血脑屏障穿透优势(图 3B-F)。

图 4：最优荧光素酶 - 底物组合与高速成像

BREP-sDTZ 组合亮度是 Antares-sCFz 的 2 倍，且比 ATP 依赖性的 Akaluc-AkaLumine(30mM)高 3.5 倍(图 4A-C)。对自由活动小鼠的高速成像显示，sDTZ 注射后可通过 15ms 曝光，连续 18 分钟同步捕捉小鼠运动轨迹与脑部生物发光信号，无明显信号衰减，实现动态追踪(图 4D)。

补充实验：毒性与稳定性

连续 5 天注射 25mM sDTZ 后，小鼠脑、心、肝、肺、肾、脾无明显病理损伤(图 S9);sDTZ 固体在 - 20℃/-80℃储存稳定，溶解后冰上可稳定数小时，满足实验操作需求(图 S3、S4)。

研究结论

本研究通过 PEG 化修饰技术突破 ATP 非依赖性荧光素酶底物的核心瓶颈，核心成果如下：1)PEG 化底物水溶性提升至 25mM，无需有机助溶剂，生物相容性显著改善;2)笼状结构屏蔽 C3 羰基，抗自氧化能力增强，结果稳定性提升;3)sDTZ-BREP 组合为目前最亮 ATP 非依赖性 BLI 系统，亮度超越 Akaluc-AkaLumine，脑部 / 肝脏成像灵敏度提升 260-1000 倍;4)实现自由活动小鼠 15ms 曝光高速成像，支持动态生物学过程追踪;5)修饰策略普适性强，可推广至 DTZ、Fz、CFz 等多种底物。该系列底物为深层组织成像、脑部动态过程(如神经元活动)、肿瘤转移追踪等研究提供高性价比工具。