preS1 缺失增强感染性，免疫耐受期患者需警惕

乙肝病毒(HBV)感染是全球主要公共卫生问题之一，有超过2.5亿人慢性感染HBV。而其中有超三分之一的人口集中在我国，人数接近1亿人。NTCP工具细胞，特别是外源表达NTCP的肝癌细胞系如HepG2-NTCP和Huh7-NTCP，因其易操作、短周期、重现性佳的特点，在乙肝病毒(HBV)研究中扮演着至关重要的角色。这些细胞模型能够有效模拟HBV的感染过程，为研究HBV的生命周期、宿主限制因子、病毒复制以及药物筛选提供了一个强大而便捷的体外平台。它们不仅有助于揭示HBV感染的分子机制，如DDX3作为宿主限制因子阻碍cccDNA转录，GPC5作为附着因子在感染入胞过程中的作用，还能通过直接与NTCP相互作用或下调NTCP表达来筛选和验证抗病毒药物的活性，例如环孢菌素A及其衍生物、雷帕霉素及其衍生物等。此外，这些工具细胞还促进了对HBV宿主特异性分子的发现，为发展支持HBV感染的小动物模型提供了可能，这对于乙肝相关研究和药物开发具有重大意义。

基本信息

英文标题：Naturally occurring 5′ preS1 deletions markedly enhance replication and infectivity of HBV genotype B and genotype C

中文标题：天然存在的 5' preS1 缺失显著增强乙肝病毒(HBV)基因型 B 和 C 的复制和感染性

发表期刊：《Gut》

影响因子：25.8

作者单位：

1.Department of Infectious Diseases, Huashan Hospital, Fudan University, Shanghai, China

2.Liver Research Center, Rhode Island Hospital and Warren Alpert Medical School of Brown University, Providence, RI, United States

3.State Key Laboratory of Molecular Vaccinology and Molecular Diagnostics, School of Public Health, Xiamen University, Xiamen, China

4.Department of Pathobiology, Key Laboratory of Medical Molecular Virology, School of Basic Medical Sciences, Fudan University, Shanghai, China

作者信息：

Jing Li，Jisu Li;通讯作者(Shuping Tong：shuping_tong_md@brown.edu;Jisu Li：Ji_su_li_md@brown.edu;Jiming Zhang：jmzhang@fudan.edu.cn)

研究背景

HBV 基因型 B 和 C 在慢性感染中常出现 5' preS1 区域 15/18nt 缺失，该缺失覆盖 preS1 起始 ATG，使下游 33nt 处的 ATG 启动翻译，截断大包膜蛋白(L 蛋白)11 个氨基酸，结构类似基因型 D 的 L 蛋白。这类缺失与肝硬化和肝癌相关，但对 HBV 复制和感染性的影响尚未明确。现有 HBV 体外感染模型多基于基因型 D，非 D 基因型感染效率低。本研究探究天然 preS1 缺失对 HBV 基因型 B 和 C 复制、感染性的调控作用，为优化非 D 基因型 HBV 感染模型及临床治疗提供依据。

研究方法

从晚期肝纤维化患者血清中扩增 HBV 基因组，构建 1.1mer/1.3mer 复制 competent 载体，通过定点突变引入 preS1 缺失、插入或点突变。转染 HepG2 细胞后，收集病毒颗粒感染 HepG2/NTCP 和分化型 HepaRG 细胞，检测指标包括：1)Northern blot 检测 HBV RNA;2)Southern blot 检测复制型 DNA 和 cccDNA;3)Western blot 检测包膜蛋白和核心蛋白;4)ELISA 检测 HBsAg/HBeAg;5)qPCR 定量病毒 DNA;6)天然琼脂糖凝胶电泳分析病毒颗粒;7)FITC 标记 preS1 肽检测细胞结合能力;8)突变 preS1 区域 ATG 验证 L 蛋白的作用。

实验结果

图 1：HBV preS1 序列比对与祖先型分析

序列比对显示，基因型 A/B/C/F/H 的 preS1 区域比基因型 D 长 33nt，含两个 MG 二肽(图 1A、B);基因型 D 的 preS1 可与其他哺乳动物嗜肝病毒对齐，提示祖先 HBV 可能具有基因型 D 样短 preS1(图 1C)。患者样本中发现的 18nt 缺失位于基因型 C 的 preS1 区域(图 1A 方框)。

图 2：preS1 缺失增强 HBV 感染性

转染 HepG2 细胞后，含 15/18nt 缺失的病毒(42.1、42.7)感染 HepG2/NTCP 细胞后，HBeAg、HBsAg 和复制型 DNA 水平显著高于野生型(42.5)(图 2A-C)。在基因型 B(43.1)和 C(55.3)中人工引入 18nt 缺失，同样增强感染性;而向基因型 D 插入 33nt 则降低感染性(图 2D-J)。cccDNA 检测证实缺失突变感染后 cccDNA 水平更高(图 2G、K)。

图 3：preS1 缺失促进 HBV 复制和病毒颗粒分泌

转染 HepG2 细胞后，preS1 缺失突变体的 HBV RNA(3.5kb/2.1/2.4kb)、核心蛋白、复制型 DNA 水平均显著升高(图 3A-C);病毒颗粒分泌增加，裸核心颗粒也增多(图 3D、F);HBsAg/HBeAg 分泌和病毒 DNA 定量均高于野生型(图 3G-I)。

图 4：HepaRG 细胞中缺失突变的感染性增强

在分化型 HepaRG 细胞中，含 preS1 缺失的病毒(42.1、42.7、55.3-15/18)感染后，HBeAg、HBsAg 和复制型 DNA 水平显著高于野生型(图 4A-C)，证实缺失增强感染性的现象不依赖细胞系。

图 5：回补 preS1 缺失降低病毒感染性

向天然含 18nt 缺失的基因型 C 克隆(Kca11.1、Kca11.2)回补 18nt 后，病毒颗粒分泌减少(图 5B)，感染 HepG2/NTCP 细胞后的 HBsAg 水平显著降低(图 5C)，反向证实 preS1 缺失对感染性的增强作用。

图 6：preS1 区域 ATG 突变对感染性的影响

突变 preS1 第一个 ATG(阻断全长 L 蛋白表达)，显著增强基因型 C 的感染性;突变第二个 ATG(阻断截断型 L 蛋白表达)，则降低感染性(图 6F-H)。而 ATG 突变对病毒复制、颗粒分泌无明显影响(图 6A-E)，证实截断型 L 蛋白是感染性增强的关键。

图 7：截断型 preS1 肽增强结合能力和感染抑制作用

基因型 C 的 preS1 肽(13-59，缺失 N 端 11aa)对 HBV 感染的抑制效果优于全长肽(2-59)(图 7A-B);该截断肽与 HepG2/NTCP 细胞的结合能力更强，EC₅₀值更小(图 7C-E)，且在基因型 B 中也存在类似现象(图 7D)，提示 N 端 11aa 缺失增强 preS1 与受体的结合。

研究结论

本研究明确天然存在的 HBV 5' preS1 15/18nt 缺失的核心功能，结论如下：1)该缺失通过截断 L 蛋白 N 端 11 个氨基酸，显著增强基因型 B 和 C 的复制效率、病毒颗粒分泌及感染性;2)向非 D 基因型引入该缺失或突变 preS1 第一个 ATG，可提升其体外感染效率，解决非 D 基因型 HBV 感染模型的局限;3)截断型 preS1 肽与 NTCP 结合能力更强，为抗病毒药物设计提供新思路;4)临床中 “免疫耐受期” 患者若存在 preS1 缺失和 BCP 突变，可能已出现肝纤维化，需及时启动抗病毒治疗。