MiR-140-5p 通过靶向 TLR4 守护巨噬细胞

Reporter THP1 Cell Line 细胞系是以 THP-1 为工具细胞，采用慢病毒感染的方式，构建稳定表达报告基因的细胞系，可用于检测信号通路转导。在被PMA、INF-α等刺激后，目标信号通路被激活，会启动下游特定基因的表达，这个表达过程会同时带动“报告基因”的表达。通过检测报告基因的信号强度，可以间接、定量、灵敏地衡量该信号通路的激活程度。

THP-1细胞本身来源于人单核细胞，可以分化为巨噬细胞样细胞，是研究先天免疫的经典模型。报告基因株的建立使其功能更强大。THP-1报告基因株是免疫学、炎症性疾病、药物研发等领域不可或缺的强大工具。它可以将一个复杂的、内在的生物学过程(信号通路激活/基因表达)转变为一个易于检测、可定量的物理信号(光或荧光)。这使得研究人员能够高通量地筛选药物，精确地量化免疫反应强度，直观地研究信号通路机制。

基本信息

英文标题：MiR-140-5p inhibits oxidized low-density lipoprotein-induced oxidative stress and cell apoptosis via targeting toll-like receptor 4

中文标题：MiR-140-5p 通过靶向 toll 样受体 4(TLR4)抑制氧化型低密度脂蛋白(ox-LDL)诱导的氧化应激和细胞凋亡

发表期刊：《Gene Therapy》

影响因子：4.5

作者单位：

Department of Endocrinology and Metabolism, Shanghai Ninth People’s Hospital, Shanghai Jiao Tong University School of Medicine, Shanghai, China

作者信息：

Huifang Liu，Ziming Mao;通讯作者(Fengling Chen：chenfl1101@126.com)

研究背景

动脉粥样硬化(AS)是心血管疾病的主要诱因，其核心病理过程包括 ox-LDL 诱导的血管内皮损伤、巨噬细胞活化、泡沫细胞形成及氧化应激介导的细胞凋亡。TLR4 作为先天免疫关键分子，在 ox-LDL 诱导的巨噬细胞脂质蓄积和凋亡中发挥重要作用。MicroRNA(miRNA)广泛参与 AS 进展，但 miR-140-5p 在 AS 中的功能尚未明确。本研究以 THP-1 巨噬细胞为模型，探究 miR-140-5p 对 ox-LDL 诱导的 AS 相关病理过程的调控作用及分子机制，为 AS 治疗提供新靶点。

研究方法

以 THP-1 巨噬细胞为研究对象，用 PMA 诱导其分化为成熟巨噬细胞，通过 ox-LDL(50 mg/L)处理构建 AS 体外模型。转染 miR-140-5p 模拟物(mimic)或抑制剂(inhibitor)调控其表达，检测指标包括：1)流式细胞术检测细胞凋亡;2)油红 O 染色观察脂质蓄积，试剂盒检测总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)水平;3)ROS、MDA、SOD 试剂盒评估氧化应激程度;4)Western blot 检测 CD36、TLR4 蛋白表达;5)双荧光素酶报告基因验证 miR-140-5p 与 TLR4 的靶向关系;6)Transwell 共培养体系探究巨噬细胞与血管平滑肌细胞(HUVSMC)的相互作用。

实验结果

图 1：ox-LDL 诱导 THP-1 巨噬细胞凋亡并下调 miR-140-5p 表达

ox-LDL 以剂量依赖性(0-100 mg/L)和时间依赖性(0-48 h)促进 THP-1 巨噬细胞凋亡(图 1a、b)。同时，miR-140-5p 表达随 ox-LDL 浓度升高、处理时间延长而显著降低(图 1c、d)，提示 miR-140-5p 可能参与 ox-LDL 诱导的巨噬细胞损伤调控。

图 2：miR-140-5p 抑制 ox-LDL 诱导的泡沫细胞形成

转染 miR-140-5p mimic 可显著上调其表达，抑制剂则显著下调(图 2a)。ox-LDL 处理后，miR-140-5p 过表达组的 CD36 蛋白表达升高(图 2b)，油红 O 染色强度降低(图 2c、d)，TC 和 TG 水平显著下降(图 2e、f);反之，miR-140-5p 沉默组脂质蓄积增加，证实 miR-140-5p 可抑制 ox-LDL 诱导的巨噬细胞泡沫化。

图 3：miR-140-5p 减轻 ox-LDL 诱导的氧化应激和细胞凋亡

miR-140-5p 过表达组的 ROS、MDA 水平显著降低，SOD 活性升高(图 3a、b、c);流式细胞术显示，该组细胞凋亡率(7.8%)显著低于对照组(12.2%)和抑制剂组(19.5%)(图 3d、e)。miR-140-5p 沉默则加剧氧化应激和凋亡，表明其对 ox-LDL 诱导的巨噬细胞损伤具有保护作用。

图 4：miR-140-5p 靶向 TLR4 并调控 HUVSMC 增殖

Transwell 共培养实验显示，miR-140-5p 过表达的巨噬细胞可促进 HUVSMC 增殖(图 4a、b)。生物信息学预测及双荧光素酶报告基因实验证实，miR-140-5p 可直接结合 TLR4 的 3’UTR 区域(图 4c、d)。Western blot 显示，miR-140-5p 过表达显著下调 TLR4 蛋白表达，抑制剂则上调(图 4e、f)，明确 TLR4 是 miR-140-5p 的直接靶标。

图 5：miR-140-5p 调控 AS 的分子机制示意图

ox-LDL 处理后，巨噬细胞中 miR-140-5p 表达下调，解除对 TLR4 的抑制;TLR4 过度激活促进 ROS 生成、泡沫细胞形成及细胞凋亡，加速 AS 进展;而 miR-140-5p 可通过靶向抑制 TLR4，阻断上述病理过程，发挥抗 AS 作用(图 5)。

研究结论

本研究首次明确 miR-140-5p 在 AS 中的保护作用，核心结论如下：1)ox-LDL 以剂量和时间依赖性下调巨噬细胞中 miR-140-5p 表达，同时诱导细胞凋亡;2)miR-140-5p 过表达可抑制 ox-LDL 诱导的泡沫细胞形成(减少脂质蓄积)、减轻氧化应激(降低 ROS、MDA，升高 SOD)、抑制细胞凋亡;3)TLR4 是 miR-140-5p 的直接靶标，miR-140-5p 通过结合 TLR4 的 3’UTR 抑制其表达，进而发挥抗 AS 作用;4)miR-140-5p 可通过调控巨噬细胞功能间接促进 HUVSMC 增殖，参与血管修复。该研究揭示了 miR-140-5p/TLR4 通路在 AS 中的调控网络，为 AS 的诊断和治疗提供了新的分子靶点。