上皮细胞分泌的细胞外基质 niche 驱动肠道类器官形成研究

肠道类器官作为模拟肠道上皮结构和功能的重要模型，其培养长期依赖成分不明的动物来源基质(如 Matrigel)，限制了对细胞外基质(ECM)在类器官发育中作用的解析，也阻碍了临床转化应用。目前，合成水凝胶虽能模拟物理特性，但对 ECM 的生物学功能(如干细胞 niche 维持、细胞分化调控)研究不足。本研究通过可调谐的化学定义合成水凝胶，系统探究 ECM 在小鼠和人类肠道类器官发育中的作用，揭示上皮细胞可分泌自身 ECM 形成干细胞 niche，且该分泌的 ECM 能替代外源性 ECM 支持类器官形成，为无动物来源基质的类器官培养提供新策略。

来自瑞士洛桑联邦理工学院的团队在《Developmental Cell》(2025 年 12 月，Vol. 60)发表了题为An extracellular matrix niche secreted by epithelial cells drives intestinal organoid formation的研究。

核心内容如下：

研究方法：

模型构建：使用 PEG 基合成水凝胶(含 RGD 或 GFOGER 整合素结合肽)，对比有无外源性层粘连蛋白 - 1(Lam-1)及 Matrigel 中，小鼠肠道干细胞(mISCs)的类器官形成效率;

ECM 分析：通过 RNA-seq、蛋白质组学鉴定上皮细胞分泌的 ECM 成分，免疫荧光定位层粘连蛋白等分子的空间分布;

功能验证：收集上皮细胞分泌的条件培养基(CM)，整合到合成水凝胶中，评估其支持类器官形成的能力;通过 shRNA 敲低层粘连蛋白链(Lama3)，验证内源性 ECM 的作用。

关键结果：

无外源性 ECM 时，mISCs 形成富含再生细胞(LY6A⁺)的上皮结构，这些细胞分泌层粘连蛋白 - rich 基底膜，形成内源性干细胞 niche，支持类器官形成;

鉴定出关键层粘连蛋白链：Lama3、Lamb3、Lamc2(泛表达)及 Lamb1、Lamc1(局限于隐窝区域)，其中 Lam-332(Lama3/Lamb3/Lamc2)是再生细胞分泌的主要亚型;

上皮细胞分泌的 ECM(通过 CM 浓缩获得)能替代外源性 Lam-1，显著提高类器官形成效率(达 Matrigel 水平)，并促进细胞退出再生状态、实现谱系分化;

Lama3 敲低导致 mISCs 滞留于再生状态(LY6A⁺比例 > 90%)，证实内源性 ECM对类器官发育的必要性;

人类小肠类器官在无外源性层粘连蛋白的 PEG 水凝胶中可存活，虽再生标志物(ANXA1)上调、干细胞标志物(OLFM4)下调，但细胞分区不如小鼠模型明确，提示需优化人源类器官培养条件。

实验结果

图 1：3D 水凝胶中鼠肠道干细胞(mISCs)的类器官形成与再生表型

该图探究不同基质(PEG 水凝胶 ±Lam-1、Matrigel)对 mISCs 的影响。(A)展示 PEG 水凝胶培养体系示意图;(B-C)光镜显示 4 天内 mISCs 形成的集落形态，GFOGER 肽作为整合素配体时集落形成效率高于 RGD，且无 Lam-1 时上皮层较薄;(D)流式分析显示，无 Lam-1 的 PEG 水凝胶中 LY6A⁺再生细胞比例(GFOGER 约 53%、RGD 约 80%)显著高于 Matrigel(约 7%)，高接种密度可降低再生细胞比例;(E)免疫荧光证实，通过调控 Wnt/Notch 信号，无 Lam-1 时 mISCs 仍能分化为干细胞(OLFM4⁺)、潘氏细胞(LYZ1⁺)等谱系;(F-H)RNA-seq 聚类和反卷积分析显示，细胞类型组成主要受分化条件(如 ENRCV、ENR)影响，无 Lam-1 时再生标志物高表达。

图 2：层粘连蛋白在类器官中的空间分布

该图分析层粘连蛋白的内源性分泌与定位。(A-B)免疫荧光显示，无 Lam-1 的 PEG 水凝胶中，层粘连蛋白主要在干细胞 niche(FABP1⁻区域)表达，而 Matrigel 中呈外周分布，初始 mISCs 无层粘连蛋白表达;(C-D)通过 ROI 拉直分析，无 Lam-1 时层粘连蛋白强度与 FABP1(肠上皮标志物)呈负相关，Matrigel 中无明显关联;(E)定量显示 PEG 水凝胶中两者相关性显著(rₚ=-0.2089)，证实层粘连蛋白在干细胞 niche 的特异性分布。

图 3：内源性层粘连蛋白链的鉴定

该图通过转录组和蛋白质组筛选关键层粘连蛋白。(A)热图显示，无 Lam-1 时 Lama3、Lamb3、Lamc2 等表达上调;(B)免疫荧光证实 LAMB1(胞内及外周)和 LAMC1(基底侧)在无 Lam-1 类器官中的定位;(C-E)蛋白质组分析显示，无 Lam-1 时 LAMA3、LAMB3、LAMC2 富集，而 Matrigel 中以 LAMA1 为主;(F)共定位显示层粘连蛋白与再生标志物 LY6A 共表达，证实再生细胞为分泌源。

图 4：再生细胞分泌 ECM 的功能验证

该图评估条件培养基(CM)中 ECM 的活性。(A-C)2D 培养显示，GFOGER 肽可替代胶原 I 支持 mISCs 存活，且细胞分泌 LAMB1、COL4 等 ECM 成分;(D-E)CM 经 50kDa 滤膜浓缩后(CM R)，其包被表面可支持 mISCs 黏附，效果接近胶原 I，证实分泌 ECM 的功能性。

图 5：分泌 ECM 替代外源性 Lam-1 的效果

该图验证 CM R 在 3D 培养中的作用。(A-B)PEG 水凝胶中加入 CM R 后，集落形成效率显著提高，接近 Matrigel 水平;(C)流式显示 LY6A⁺细胞比例降低(类似 PEG-Lam1 组);(D-E)分化后出现芽状结构，免疫荧光证实肠上皮(FABP1⁺)和干细胞(OLFM4⁺)的分区;(F-G)无 Wnt 激动剂时，CM R 支持类器官形成效率达 4%(与 Matrigel 相当)，证实其作为干细胞 niche 的功能。

图 6：Lama3 敲低对类器官发育的影响

该图验证内源性 ECM 的必要性。(A-B)shRNA 敲低 Lama3 后，Lama3 表达下降 12 倍，其他再生标志物(Ly6a)不受影响;(C-F)敲低细胞在 PEG 水凝胶中 LY6A⁺比例 > 90%(野生型 < 18%)，补充 Lam-1 或 CM R 仅部分恢复，证实 Lama3 对细胞退出再生状态的关键作用。

图 7：人类小肠类器官在 PEG 水凝胶中的表现

该图探索人源模型的适用性。(A-B)人类小肠干细胞(hISCs)在无 Lam-1 的 PEG 水凝胶中可形成类器官，ANXA1(再生标志物)上调、OLFM4 下调;(C)免疫荧光显示细胞多样性，但隐窝 - 绒毛分区不明显;(D-E)2D 培养中 hISCs 难以形成单层，提示需优化培养条件。

全文总结

本研究通过合成水凝胶模型揭示：肠道上皮细胞(尤其是再生细胞)可分泌内源性 ECM(以 Lam-332 为主)，形成干细胞 niche，支持类器官发育，无需依赖外源性基质。关键发现包括：再生细胞分泌的层粘连蛋白可替代 Matrigel 中的外源性 ECM;Lama3 是内源性 ECM 的核心成分，其缺失导致细胞滞留于再生状态;上皮细胞分泌的 ECM 经浓缩后可高效支持类器官培养。该研究为类器官培养摆脱动物来源基质提供了实验依据，推动临床转化。局限性在于人类类器官的细胞分区和培养条件仍需优化，未来需深入探究其他 ECM 成分(如胶原)的作用及跨物种适用性。