四种 RTKI 以非竞争性方式抑制 VEGFR2， potency 与激酶结合数据高度一致

检测细胞株广泛应用于药物发现、抗体开发、基因研究和毒性评估等领域。基于D-Luciferase的报告基因细胞株及其荧光素酶检测方法在药物初筛/复筛、表位竞争、药物生物活性检测等多方面展现了广泛的应用潜力。报告基因法已被药典收录，为国家认可的检测方法。报告基因细胞株多用于监测特定的生物过程或信号通路。

HEK293细胞因子报告基因细胞株是以HEK293为工具细胞，采用慢病毒感染的方式构建，不仅能够稳定表达细胞因子受体蛋白，并且能够表达荧光素酶报告基因，是基于转录因子信号通路构建的荧光素酶报告基因细胞系。当细胞因子结合受体蛋白后，细胞因子与受体蛋白相互作用，激活转录因子信号通路，从而激活荧光素酶的表达。荧光信号的强弱即代表信号通路的激活效果，因此可用于相关药物的体外效果评价，筛选抗体以及筛选信号通路的激活剂或抑制剂。

基本信息

英文标题：Effects of receptor tyrosine kinase inhibitors on VEGF₁₆₅a- and VEGF₁₆₅b-stimulated gene transcription in HEK-293 cells expressing human VEGFR2

中文标题：受体酪氨酸激酶抑制剂对表达人 VEGFR2 的 HEK-293 细胞中 VEGF₁₆₅a 和 VEGF₁₆₅b 刺激基因转录的影响

发表期刊：《British Journal of Pharmacology》

影响因子：7.7

作者单位：

Cell Signalling Research Group, School of Life Sciences, University of Nottingham, Nottingham, UK

作者信息：

Marc A. Egerman¹、Yuhong Zhang¹、Romain Donne¹、Jianing Xu¹、Abhilash Gadi¹、Corissa McEwen¹、Hunter Salmon¹、Kun Xiong²、Yu Bai²、Mary Germino³、Kevin Barringer⁴、Yasalp Jimenez⁴、Maria del Pilar Molina-Portela⁴、Tea Shavlakadze¹、David J. Glass¹*;通讯作者：

Joanne J Carter、Amanda J Wheal、Stephen J Hill、Jeanette Woolard

研究背景

血管内皮生长因子(VEGF)及其受体 VEGFR2 是肿瘤血管生成的核心调控因子，靶向 VEGFR2 的受体酪氨酸激酶抑制剂(RTKI)是癌症治疗的重要策略。VEGF-A 通过可变剪接产生不同亚型，其中 VEGF₁₆₅a 具有促血管生成活性，而 VEGF₁₆₅b 为弱激动剂，具有抗血管生成潜力。然而，RTKI 对这两种剪接变体刺激 VEGFR2 信号的影响，缺乏活细胞内的定量药理学分析。VEGFR2 激活后可通过钙调神经磷酸酶 - 活化 T 细胞核因子(NFAT)通路调控基因转录，本研究利用 NFAT - 荧光素酶报告基因系统，在表达人 VEGFR2 的 HEK-293 细胞中，定量分析四种代表性 RTKI 与两种 VEGF 变体的相互作用，为 RTKI 的临床应用提供理论依据。

研究方法

采用稳定表达人 VEGFR2 和 NFAT - 荧光素酶报告基因(含 NFAT 响应元件和荧光素酶基因 luc2P)的 HEK-293 细胞，培养基为含 10% 胎牛血清和 0.5% G418 的 DMEM。实验分组包括：不同浓度 VEGF₁₆₅a/VEGF₁₆₅b 刺激组、RTKI(西地尼布、帕唑帕尼、索拉非尼、凡德他尼)预处理组(1 小时)+ VEGF 变体刺激组。细胞接种于 96 孔板(4×10⁴细胞 / 孔)，VEGF 刺激 5 小时后，加入 ONE-Glo 荧光素酶检测试剂，通过 Topcount 酶标仪检测发光信号。采用 GraphPad Prism 6 进行非线性回归分析，计算 EC₅₀(激动剂半数有效浓度)、IC₅₀(抑制剂半数抑制浓度)，利用 Black-Leff 操作模型分析激动剂亲和力(Kₐ)和效能(τ)，统计学检验采用 t 检验或 ANOVA，P<0.05 为差异有统计学意义。

实验结果

图 1：VEGF₁₆₅a 对 NFAT 介导基因转录的刺激及西地尼布的抑制作用

VEGF₁₆₅a 以浓度依赖方式激活 NFAT - 荧光素酶活性，pEC₅₀=9.66±0.05(n=10)，最大响应为基础水平的 8.30±0.85 倍(图 1A、B)。1 nM VEGF₁₆₅a 的刺激作用可被西地尼布浓度依赖性抑制，pIC₅₀=9.13±0.01(n=5)，与纯化 VEGFR2 激酶结构域的结合数据(pKd=8.96)高度一致(图 1C、表 2)。西地尼布仅在浓度 > 10 nM 时轻微抑制基础 NFAT 活性(P<0.05)，表明其对其他酪氨酸激酶的干扰较小(图 1D)。

图 2：其他 RTKI 对 VEGF₁₆₅a 刺激 NFAT 活性的抑制作用

帕唑帕尼(pIC₅₀=8.25±0.03，n=5)、索拉非尼(pIC₅₀=8.01±0.06，n=5)、凡德他尼(pIC₅₀=6.72±0.03，n=5)均能浓度依赖性抑制 1 nM VEGF₁₆₅a 诱导的 NFAT 活性(图 2A-D)。四种 RTKI 的 pIC₅₀值均与纯化 VEGFR2 激酶结构域的结合数据(表 2)相符，其中索拉非尼和凡德他尼在高浓度时对基础活性有轻微抑制(分别降低 25.0% 和 23.0%，P<0.05)，可能与干扰其他激酶相关。

图 3：RTKI 对 VEGF₁₆₅a 浓度 - 反应曲线的影响

四种 RTKI 均以非竞争性方式抑制 VEGF₁₆₅a 的刺激作用：显著降低最大响应(Eₘₐₓ)，仅西地尼布在高浓度时对 EC₅₀有轻微影响(P<0.05)(图 3A-D)。例如，3 nM 西地尼布可使 VEGF₁₆₅a 的 Eₘₐₓ降至 8.8±1.9%(P<0.05)，30 nM 索拉非尼使 Eₘₐₓ降至 18.9±8.9%(P<0.05)，证实 RTKI 通过作用于 VEGFR2 胞内激酶域，阻断信号传导而非竞争配体结合位点(表 3)。

图 4：VEGF₁₆₅b 的药理学特性及西地尼布的抑制作用

VEGF₁₆₅b 同样能浓度依赖激活 NFAT 活性，但效能显著低于 VEGF₁₆₅a，最大响应仅为后者的 62.1±1.2%(n=5)，而两者 pEC₅₀相近(VEGF₁₆₅b：9.21±0.08，n=5)(图 4A、表 1)。操作模型分析显示，VEGF₁₆₅b 对 VEGFR2 的 pKₐ=8.83±0.13，效能参数 τ=1.65±0.23(需 60.1% 受体结合才能达到半数最大响应)。3 nM VEGF₁₆₅b 的刺激作用可被西地尼布浓度依赖性抑制，pIC₅₀=9.38±0.07(n=5)，与 VEGF₁₆₅a 组抑制 potency 相近(图 4B、表 2)。

研究结论

本研究首次揭示 GOLM1 通过形成 GOLM1-EGFR-STAT3-CSN5 正反馈环路介导肝癌乐伐替尼获得性耐药：GOLM1 过表达激活 EGFR-STAT3 通路，转录上调 CSN5;CSN5 通过去泛素化修饰稳定 GOLM1 蛋白，进一步放大通路激活，最终导致肿瘤细胞对乐伐替尼耐药、增殖侵袭能力增强。临床样本证实，GOLM1 在乐伐替尼非应答者中高表达，且与 EGFR-STAT3-CSN5 通路共激活相关。敲低 GOLM1 可显著增强乐伐替尼的抗肿瘤效果，提示 GOLM1 可作为乐伐替尼耐药的预测生物标志物和治疗靶点，为改善晚期 HCC 的临床疗效提供了新策略。