人原代抗 CD19 CAR-NK 细胞制备新策略及其在 B 细胞血液瘤中的应用

自体 CD19-CAR-T 治疗 B 细胞血液瘤虽有效，但存在制备周期长、毒性高的局限;异基因 CAR-NK 因无 GVHD 风险成替代方向，却依赖有肿瘤污染风险的 K562 饲养层。日本新潟大学 Nobuhiro Kubo 团队在《Biomedicine & Pharmacotherapy》发表方案：用抗 CD2 / 抗 NKp46 抗体 + 四细胞因子(IL-2/IL-12/IL-18/IL-21)实现 NK 无饲养层扩增(21 天 1549 倍，纯度 91.1%)，再转导抗 CD19-BB-ζ CAR(效率 57.9%)，该 CAR-NK 对 B 细胞血液瘤强效杀伤，提供安全可规模化的制备方案。

本研究旨在开发无饲养层的人原代 NK 扩增及 CAR 转导技术。方法：从健康人 PBMC 出发，用抗 CD2 / 抗 NKp46 抗体 + 细胞因子扩增 NK，第 6 天转导抗 CD19-BB-ζ CAR，验证杀伤活性。结果：21 天 NK 扩增 1549 倍(纯度 91.1%)，CAR 转导效率 57.9%，CAR-NK 对 CD19+B 细胞瘤杀伤率较 Mock-NK 提升 40%-60%，无 T 细胞污染。结论：该方案可高效制备功能性 CAR-NK，助力异基因 B 细胞血液瘤治疗。

实验方法

材料准备：细胞系包括 B 细胞血液瘤(OP1、Raji、RS4;11)、髓系白血病(K562、THP-1、KG1)及 293T 包装细胞;试剂含抗 CD2 / 抗 NKp46 抗体微球(Cloudz 试剂盒)、四细胞因子、RD114 假型逆转录病毒载体(抗 CD19-BB-ζ CAR+GFP)、流式抗体;仪器涵盖 FACSCaliber 流式细胞仪、Novaseq 6000 测序仪，实验经新潟大学伦理批准(#2015-2686)，健康志愿者提供 PBMC。

人原代 NK 细胞无饲养层扩增：PBMC 经 Ficoll 离心分离，按 6×10⁴个 NK 细胞 / 孔接种，用含 10% FBS 的 SCGM 培养基，加抗体微球及细胞因子(IL-2 27ng/mL、IL-12/IL-18/IL-21 各 10ng/mL)，37℃、5% CO₂培养;第 10 天移除微球，换含 20ng/mL IL-2 的培养基，每 2-3 天补加 IL-2，第 10/14/21 天检测 NK 纯度(CD56⁺CD3⁻)及扩增倍数，设无抗体组与 K562 饲养层对照组。

抗 CD19 CAR-NK 细胞构建：扩增第 3/6/10 天，NK 细胞与 CAR 逆转录病毒上清共孵育(Retronectin 辅助)，7 天后检测 GFP⁺细胞比例确定第 6 天为最优转导时间;转导后继续培养 7-14 天，流式验证 CAR 表达及 CD3⁺细胞污染情况。

功能验证：体外杀伤实验：NK/CAR-NK 与靶细胞按不同 E:T 比共培养，4/24/96 小时流式检测靶细胞存活率;CD107a 脱颗粒实验：共培养 4 小时染色 CD107a，流式分析激活比例;intracellular 细胞因子检测：加 Brefeldin A 共培养 4 小时，染色 IFN-γ 评估分泌能力;转录组分析：新鲜 NK 与扩增 NK 行 RNA-seq，分析差异基因及富集通路。

实验结果

图1：无饲养层 NK 细胞扩增效率验证

该图对比有无抗 CD2 / 抗 NKp46 抗体的 NK 扩增效果：A 图流式显示，第 0 天 PBMC 中 NK 占比 16.8%，第 10-21 天抗体组 NK 纯度升至 82.4%-91.1%;B 图 14 例供体数据证实抗体组各时间点纯度均显著高于无抗体组;C 图抗体组 NK 扩增倍数随时间递增(第 10 天 75.3 倍、14 天 340.7 倍、21 天 1549 倍)，远超无抗体组(21 天 120 倍);D、E 图 5 例供体验证，抗体组第 10、21 天的纯度和扩增倍数均显著更高，证实抗体可高效驱动 NK 无饲养层扩增。

图2：扩增 NK 细胞表面标志物动态变化

该图分析扩增过程中 NK 细胞激活及受体表达：激活标志物 CD25 第 10 天达峰值(65.2%)后下降，CD69 持续上调至第 21 天(88.7%);杀伤相关受体中，NKG2D 第 10 天暂时下调(42.3%)、第 21 天回升至 79.5%，NKp30 第 10 天上调(72.1%)，NKp44 仅第 21 天表达(35.6%)，DNAM-1 与 NKp46 全程高表达(>80%);抑制性受体 NKG2A 第 10 天诱导表达(58.4%)，KIR 家族表达稳定(30%-40%)，表明扩增 NK 逐渐获得激活表型，维持核心杀伤受体表达。

图3：扩增 NK 细胞转录组特征

该图通过 RNA-seq 对比新鲜 NK(pNK)与扩增 NK(eNK)的转录差异：A 图主成分分析显示两组基因表达显著分离(PC1 占 78.41%);B 图无监督聚类验证两组 distinct 表达谱;C 图火山图显示 eNK 较 pNK 上调 3027 个基因、下调 2784 个基因;D 图趋化因子受体变化为 CCR4/CCR7 上调、CCR5/CXCR1/CXCR6 下调;GO/KEGG/Reactome 富集分析显示，eNK 中粒细胞激活、PI3K-Akt 信号、细胞因子受体互作等通路显著富集，提示扩增 NK 激活通路被激活，趋化受体变化或利于肿瘤迁移。

图4：扩增 NK 细胞对髓系白血病的杀伤活性

该图验证扩增 NK 对 K562 等髓系白血病的功能：A 图流式显示，eNK 与 K562 共培养后 CD107a⁺(45.2%)、IFN-γ⁺(32.1%)细胞占比显著高于 pNK(12.3%、8.7%);B 图统计证实 eNK 无靶细胞刺激时已高表达 CD107a/IFN-γ，共培养后进一步升高;C 图 4 小时毒性实验中，eNK 对 K562 杀伤率(E:T=8:1 时 92.3%)显著高于 pNK(45.6%);D 图对比 K562 饲养层 NK(cNK)，eNK 短期 CD107a 脱颗粒率较低(35.2% vs 58.4%);E 图 96 小时长期杀伤实验中，eNK 与 cNK 在不同供体中表现相当，证实 eNK 具备强效抗髓系白血病活性。

图5：抗 CD19 CAR-NK 的构建效率

该图优化 CAR 转导时间并验证效果：A-C 图显示，扩增第 6 天转导 GFP 载体效率最高(GFP⁺CD56⁺CD3⁻占比 52.3%，扩增 28.5 倍)，显著高于第 3 天(38.6%、15.2 倍)与第 10 天(41.8%、18.7 倍);D-E 图证实 GFP⁺细胞中 CD3⁺占比 < 0.1%，无 T 细胞污染;F 图转导抗 CD19 CAR 后，GFP⁺NK 细胞 CAR 表达率达 91.2%;G 图 CAR-NK 转导后 7 天扩增 16.6 倍、14 天 146.4 倍;H 图 CAR-NK 中 CD3⁺占比 < 0.1%，符合异基因应用要求。

图6：抗 CD19 CAR-NK 对 B 细胞血液瘤的杀伤

该图验证 CAR-NK 对 CD19⁺B 细胞瘤的特异性杀伤：A 图显示，CAR-NK 与 OP1 共培养后 CD107a⁺(68.7%)、IFN-γ⁺(52.3%)细胞占比显著高于 Mock-NK(28.5%、18.6%);B 图 4 小时毒性实验中，CAR-NK 对 OP1(82.4%)、Raji(78.5%)、RS4;11(75.2%)的杀伤率均显著高于 Mock-NK(42.3%、38.7%、35.6%)，24 小时杀伤率进一步提升至 > 90%，证实 CAR-NK 对 B 细胞血液瘤具备强效特异性杀伤。

研究结论

本研究开发的无饲养层 CAR-NK 制备方案，通过抗 CD2 / 抗 NKp46 抗体与 IL-2/IL-12/IL-18/IL-21 组合实现人原代 NK 细胞 21 天 1549 倍扩增(纯度 91.1%)，第 6 天转导抗 CD19-BB-ζ CAR 的效率达 57.9%，转导后 14 天 CAR-NK 可进一步扩增 146.4 倍且无 CD3+T 细胞污染(<0.1%)，其对 CD19+B 细胞血液瘤(OP1、Raji、RS4;11)的杀伤率较 Mock-NK 提升 40%-60%，长期杀伤能力不劣于传统 K562 饲养层扩增 NK，该方案无需肿瘤来源饲养层，符合 GMP 规模化生产要求，为异基因抗 CD19 CAR-NK 在复发难治性 B 细胞血液瘤中的临床转化提供了安全、高效的技术路径。