CD70 导向异基因 CAR-NKT 细胞：转移性肾细胞癌（mRCC）的多模态治疗新策略

转移性肾细胞癌(mRCC)占肾癌的 30%-40%，传统化疗放疗耐药，现有靶向药(VEGF 抑制剂)和免疫检查点抑制剂仍无法完全控制转移;自体 CD70-CAR-T 治疗虽有潜力，但存在制备耗时、易受肿瘤微环境(TME)抑制、自相残杀(fratricide)等局限。加州大学洛杉矶分校(UCLA)团队在《Cell Reports Medicine》(2025, 6:102321)发表研究：从人脐带血造血干祖细胞(HSPC)构建 CD70 导向的异基因 CAR-NKT 细胞(AlloCAR70-NKT)，该细胞兼具 CAR 介导的肿瘤杀伤、NKT TCR 介导的 TME 调控及同种反应 T 细胞清除能力，无需自体制备且无自相残杀风险，为 mRCC 提供 “现成可用” 的多模态治疗方案。

本研究旨在开发针对 mRCC 的异基因 CD70 导向 CAR-NKT 细胞疗法，解决传统 CAR-T 的临床局限。方法：1. 以 HSPC 为原料，通过慢病毒转导(携带 iNKT TCR、CD70 CAR 及 IL-15)和 6 周 feeder-free 培养，构建 AlloCAR70-NKT 细胞;2. 体外验证其对 RCC 细胞系、患者来源肿瘤细胞的杀伤能力，及对 TAM/MDSC 的靶向作用;3. 利用原位 / 转移 RCC 小鼠模型(NSG/NSG-SGM3)，评估体内抗肿瘤 efficacy、细胞归巢及安全性。结果：AlloCAR70-NKT 细胞纯度>95%，无自相残杀;体外可通过 CAR(CD70)和 NKR(NKG2D/DNAM-1)双机制杀伤 RCC，清除 TAM/MDSC;体内显著抑制原位及肺转移 RCC，归巢至肿瘤部位，且能清除 CD70 + 同种反应 T 细胞以增强持久性，无明显 CRS 及器官损伤。结论：AlloCAR70-NKT 细胞作为 “现成可用” 的多模态疗法，为 mRCC 治疗提供新选择。

实验方法

材料准备：HSPC 来源于脐带血 CD34 + 细胞;RCC 模型包括细胞系(786-O、ACHN，构建 CD70 敲除株)、患者来源移植瘤(PDX#22);慢病毒载体含三元件：iNKT TCR(α/β 链)、CD70 CAR(CD27 为结合域)、分泌型 IL-15(增强体内持久性);试剂包括 CD70/CD1d 抗体、NKR 阻断抗体、ELISA 细胞因子检测试剂盒;仪器涵盖流式细胞仪(MACSQuant)、活体生物发光成像系统(Spectral AMI HTX)、酶标仪(Tecan Infinite M1000)，实验符合 UCLA 动物伦理规范。

AlloCAR70-NKT 细胞构建：HSPC 经 5 阶段 feeder-free 培养(6 周)：0 阶段解冻后用慢病毒转导，1-2 阶段用淋巴祖细胞扩增 / 成熟补体诱导分化，3 阶段用 CD3/CD28 激活并加入 IL-15，4 阶段用人工 APC 扩增;通过流式筛选 CAR70+iNKT TCR + 细胞，最终获得纯度>95% 的 AlloCAR70-NKT，无 CD70 表达以避免自相残杀。

体外功能验证：肿瘤杀伤实验：将 AlloCAR70-NKT 与 RCC 细胞(786-O-FG、PDX 细胞)共培养，设置不同 E:T 比，阻断 NKG2D/DNAM-1 或 CD70 验证杀伤机制;TME 靶向实验：与原代 RCC 患者样本共培养，检测 TAM/MDSC(CD14+CD11b+HLA-DRlow)的杀伤效率;同种反应 T 细胞清除实验：与 CD70 + 同种反应 T 细胞共培养，流式检测活细胞比例及 IFN-γ 分泌。

体内 efficacy 与安全性评估：构建 NSG 小鼠原位 RCC 模型(肾包膜接种 PDX#22-FG)和转移模型(静脉接种 786-O-FG)，尾静脉注射 AlloCAR70-NKT，通过生物发光成像监测肿瘤负荷，流式检测细胞归巢(肾、肺);安全性评估：检测血清 CRS 标志物(IL-6、SAA-3)及器官损伤指标(ALT、AST、尿素)，病理分析组织炎症。

实验结果

图1：RCC 患者样本生物标志物分析

该图通过 15 例原代 RCC 样本流式分析，明确治疗靶点可行性：左图显示 RCC TME 含大量 TAM/MDSC(占免疫细胞 20% 以上)，且 TAM/MDSC 高表达 CD1d;中图验证 CD70 在 80% RCC 肿瘤细胞高表达(>50% 阳性)，且 RCC 普遍高表达 NKG2D 配体(MICA/B、ULBP-1);右图发现 TME 中 CD4+/CD8+ T 细胞高表达 CD70。结果为 AlloCAR70-NKT 的多模态靶向(CD70 + 肿瘤、CD1d+TAM、CD70 + 同种反应 T 细胞)提供临床依据。

图2：AlloCAR70-NKT 细胞构建与特性验证

该图展示细胞构建流程及关键特性：左上图为 5 阶段培养示意图，6 周后 NKT 纯度达 95.4%;右上图流式验证 CAR70 表达率>97%，且无 CD70 表达(避免 fratricide);下图对比传统 CAR70-T，AlloCAR70-NKT 的耗竭标志物(PD-1+LAG-3+TIM-3+)比例显著更低(<5% vs >30%)，且高表达 NKR(NKG2D、DNAM-1)及细胞因子(IFN-γ、Perforin)。结果证实 AlloCAR70-NKT 纯度高、无自相残杀风险、功能稳定。

图3：AlloCAR70-NKT 体外杀伤机制验证

该图通过体外杀伤实验明确双机制作用：左图显示 AlloCAR70-NKT 对 CD70+ RCC(786-O-FG)杀伤率达 90%(E:T=1:1)，对 CD70 敲除株(786-O-FGCD70-/-)仍有 40% 杀伤(依赖 NKR);中图阻断 NKG2D/DNAM-1 后，杀伤率下降 30%，阻断 CD70 后下降 50%;右图对 7 例患者来源 RCC 细胞(CD70high/medium)杀伤率均>70%，而 CAR70-T 对 CD70medium 细胞杀伤率仅 30%。结果证实 AlloCAR70-NKT 通过 CAR 和 NKR 双机制杀伤，克服抗原异质性。

图4：原位 RCC PDX 模型体内疗效

该图为 NSG 小鼠原位 RCC 模型(肾包膜接种 PDX#22-FG)结果：左图生物发光成像显示，AlloCAR70-NKT 处理组 24 天肿瘤负荷较 CAR70-T 组降低 60%;中图流式证实 AlloCAR70-NKT 优先归巢至肾(5.58%)和肺(11.0%)，而 CAR70-T 主要在脾脏富集(9.83%);右图 3D 成像显示肾肿瘤区域 AlloCAR70-NKT 浸润量是 CAR70-T 的 3 倍，且高表达 Perforin(>80%)、低表达 PD-1(<10%)。结果表明 AlloCAR70-NKT 肿瘤归巢能力强，体内杀伤活性持久。

图5：RCC 转移模型体内疗效

该图构建 3 种转移模型(PDX#22-FG、786-O-FG、786-O-FGCD70-/-)：前两种模型中，AlloCAR70-NKT 组小鼠存活期较 CAR70-T 组延长 40%，肺转移灶减少 70%;关键是 CD70 敲除模型中，CAR70-T 完全失效，而 AlloCAR70-NKT 仍维持 50% 杀伤率(依赖 NKR)。结果证实 AlloCAR70-NKT 可治疗 CD70 阳性及抗原逃逸型转移 RCC。

图6：AlloCAR70-NKT 靶向 RCC TME

该图验证 TME 调控能力：左图用原代 RCC 样本共培养，AlloCAR70-NKT 对 TAM/MDSC 杀伤率达 60%，而 CAR70-T 仅 15%;中图 3D 类器官模型(786-O+M2 型巨噬细胞)中，AlloCAR70-NKT 在缺氧条件下仍能清除 45% TAM，维持 80% 肿瘤杀伤率，而 CAR70-T 因 TAM 抑制杀伤率降至 30%;右图体内实验显示，AlloCAR70-NKT 处理后小鼠肿瘤 TAM 比例从 2.72% 降至 0.72%。结果证实 AlloCAR70-NKT 可有效清除 TME 中的免疫抑制细胞。

图7：AlloCAR70-NKT 清除同种反应 T 细胞

该图评估同种反应 T 细胞清除能力：左图体外共培养中，AlloCAR70-NKT 对 CD70 + 同种反应 T 细胞杀伤率达 70%，分泌 IFN-γ 增加 3 倍;右图体内 NSG 模型中，AlloCAR70-NKT 处理组 CD70 + 同种反应 T 细胞比例从 44.5% 降至 1.55%，且自身持久性延长至 30 天(CAR70-T 仅 16 天);流式显示 AlloCAR70-NKT 仅清除 CD70+ T 细胞，保留 CD70- T 细胞，避免免疫损伤。结果证实 AlloCAR70-NKT 可增强自身持久性且不破坏宿主免疫。

研究结论

本研究构建的 AlloCAR70-NKT 细胞具备多模态治疗优势：从造血干祖细胞规模化制备，单份脐带血可产数千剂量，解决自体 CAR-T 的 “定制化” 局限;通过 CAR(CD70)和 NKR(NKG2D/DNAM-1)双机制杀伤 RCC，同时借助 NKT TCR 清除 CD1d+ TAM/MDSC 以重塑 TME，还能选择性清除 CD70 + 同种反应 T 细胞以延长体内持久性;体内外实验证实其对 CD70 阳性及抗原逃逸型 RCC 均有效，且无明显 CRS 及器官损伤，为转移性肾细胞癌提供了 “现成可用、安全高效” 的新型免疫治疗策略，同时为其他实体瘤的异基因 CAR-NKT 疗法开发提供了范式。