乳腺癌患者来源癌相关成纤维细胞（CAF）培养体系建立及亚型异质性研究：从表型鉴定到功能验证

癌相关成纤维细胞(CAF)是乳腺癌肿瘤微环境(TME)的核心 stromal 细胞，参与肿瘤进展、转移及药物耐药，但因缺乏统一分类标准且异质性极高，其靶向治疗难以推进。传统 CAF 研究多依赖商业化细胞系，无法复刻患者体内异质性;而患者来源 CAF 培养技术复杂，亚型功能关联不明确。

俄罗斯天狼星科技大学的团队在《International Journal of Molecular Sciences》发表研究：从 5 例乳腺癌患者肿瘤组织(含脑转移样本)及正常组织中，通过胶原酶消化 + IMDM 培养基培养，建立患者来源 CAF 细胞库;结合 Costa 分类法，用免疫荧光(vimentin、αSMA、FAPα)和流式细胞术(CD90、N-cadherin)鉴定出 S1-S4 四种 CAF 亚型，明确 S1(免疫抑制型)、S4(促转移型)对化疗药敏感，S2 耐药;且缺氧激活的 S4 亚型可显著增强三阴性乳腺癌(MDA-MB-231)的转移能力。该研究为乳腺癌 CAF 亚型靶向治疗及 TME 模拟模型构建提供了患者来源的实验工具。

本研究旨在建立乳腺癌患者来源 CAF 培养体系，解析其亚型异质性及功能特征。方法：1. 从乳腺癌患者肿瘤 / 正常组织(乳腺、眼睑皮肤)分离 CAF，用胶原酶消化 + 含生长因子的 IMDM 培养基培养;2. 通过免疫荧光(vimentin、Ki-67、αSMA)和流式(CD90、FAPα、FSP1)鉴定表型，按 Costa 分类法划分亚型;3. MTT 法检测 CAF 对阿霉素、顺铂、他莫昔芬的敏感性;4. 琼脂糖包被法构建 CAF 单型 / 异质型 spheroid，脉冲缺氧处理后检测其对乳腺癌细胞迁移侵袭的影响。结果：成功建立 7 株 CAF(含 1 株脑转移来源)，鉴定出 S1(BC4f、Met-Tem)、S2(BrC1f)、S3(BC3f)、S4(BrC4f)亚型;S4/S1 对三种药物敏感(IC50 最低 0.69μM)，S2 完全耐药;缺氧激活的 S4 可使 MDA-MB-231 迁移距离增加 1.5 倍。结论：患者来源 CAF 亚型具有显著功能异质性，缺氧激活的 S4 亚型是三阴性乳腺癌转移的关键驱动因素，该培养体系可用于 CAF 靶向药物研发。

实验方法

材料准备：样本来源于 5 例乳腺癌患者肿瘤组织(BC3f、BC4f 等)、2 例正常组织(乳腺 BN120f、眼睑皮肤 NSK1f)，及脑转移样本(Met-Tem);细胞系包括乳腺癌细胞(MCF7、MDA-MB-231、SK-BR-3);试剂含胶原酶 I(20mg/mL)、IMDM 培养基(加 10% FBS、上皮细胞生长补充剂)、CAF 标志物抗体(vimentin、αSMA、FAPα)、化疗药(阿霉素、顺铂、他莫昔芬);仪器涵盖 xCELLigence 实时细胞分析仪、Nikon 荧光倒置显微镜、FACSCanto II 流式细胞仪，实验经新西伯利亚分子生物学与生物物理研究所伦理批准(Report#1, 2017.3.14)。

CAF 分离与培养：新鲜组织(1cm³)用胶原酶 I 37℃消化 15h，300×g 离心获取单细胞，接种于 IMDM 培养基;70%-80% 汇合后用 TrypLE 消化传代，STR 鉴定细胞身份，排除支原体污染;“脉冲缺氧” 处理 BrC4f(氧比例变化 7%，2 轮处理后命名 BrC4f_Hyp2)。

表型鉴定：免疫荧光：细胞固定后用 vimentin(绿色)、Ki-67(红色)、Hoechst(核蓝染)染色，ImageJ 定量阳性细胞比例;流式细胞术：检测 CD90、N-cadherin、E-cadherin、FAPα、PDGFRα 等标志物，划分 Costa 亚型(S1：FAP 高、αSMA 中;S4：αSMA 高、FAP 中;S2：标志物低表达;S3：FSP1+、PDGFRβ+)。

功能验证：药物敏感性：CAF 接种于 96 孔板，加不同浓度药物培养 48h，MTT 法测 IC50;Spheroid 形成：2% 琼脂糖包被 96 孔板，CAF 按 2500 细胞 / 孔接种形成单型 spheroid，液体覆盖法构建异质型 spheroid(CAF + 乳腺癌细胞)，FDA/PI 染色检测活力;迁移侵袭：spheroid 转移至明胶 / Matrigel 基质，24h 后测迁移距离(明胶)或星状突起(Matrigel)。

实验结果

图1：CAF 增殖动力学特征

该图用 xCELLigence 实时监测 CAF 增殖(细胞指数 CI 反映 adhesion 和增殖)：a 图显示 CI 曲线三阶段(初始 adhesion、增殖、平台期);b 图对比 7 株 CAF 与乳腺癌细胞系：MCF7/MDA-MB-231 增殖快(倍增时间 40h)，患者来源 CAF 中 BrC4f(S4)adhesion 快、平台期长;BC3f(S3)、BC4f(S1)adhesion 耗时久(20-40h 启动增殖);正常 CAF(BN120f、NSK1f)增殖慢(70h 启动增殖)。结果表明患者来源 CAF 增殖异质性显著，肿瘤来源 CAF 增殖能力强于正常 CAF。

图2：CAF 的 vimentin 与 Ki-67 表达

该图通过免疫荧光验证 CAF 的间充质表型及增殖活性：a-d 图显示所有 CAF 均高表达 vimentin(绿色，胞质骨架清晰)，乳腺癌细胞系中 MDA-MB-231(间充质型)vimentin 阳性，MCF7(上皮型)阴性;e 图 Ki-67(增殖标志物)统计：肿瘤来源 CAF 中 BrC1f(S2)最高(≤50%)，BrC4f(S4)、BC3f(S3)次之(1%-50%)，正常 CAF(BN120f、NSK1f)最低(<1%)。结果证实培养的细胞为间充质来源，且肿瘤 CAF 增殖活性显著高于正常 CAF。

图3：CAF 的流式表型分析

该图通过流式明确 CAF 的表面标志物差异：a 图 CD90(成纤维细胞标志物)：BrC4f(S4)为 CD90high，BC3f/BC4f(S3/S1)为 CD90+，Met-Tem(S1，脑转移来源)为 CD90low;b-c 图：所有 CAF 均高表达 N-cadherin(间充质标志)、低表达 E-cadherin(上皮标志)，仅 Met-Tem 例外(N-cadherinlow);d-e 图 EGFR/PDGFRα：正常 CAF(BN120f/NSK1f)为 EGFRhigh，肿瘤 CAF 中 Met-Tem/BrC1f(S1/S2)为 EGFRlow，PDGFRα 仅 Met-Tem/BrC1f 为 low 表达;h 图 CD44high/CD24low(干细胞样表型)：所有 CAF 均符合该表型，证实无上皮细胞污染。结果为 CAF 亚型划分提供分子依据。

图4：CAF 的特异性标志物免疫荧光

该图验证 CAF 关键功能标志物表达：a 图 FSP1(S100A4，促转移)：BC4f(S1)、BrC4f(S4)高表达，BrC1f(S2)低表达;b 图 F-actin(细胞骨架)：所有 CAF 均阳性，证实结构完整性;c 图 FAPα(免疫抑制相关)：BC3f(S3)、BC4f(S1)高表达，BrC1f(S2)中表达;d 图 αSMA(肌成纤维细胞标志)：BrC4f(S4)高表达(胞质应力纤维明显)，BC4f(S1)中表达，BrC1f(S2)低表达;e 图 EGFR：正常 CAF 高表达，肿瘤 CAF 中 Met-Tem/BrC1f 低表达。结果与流式一致，明确 S1(FAP 高)、S4(αSMA 高)的功能特征。

图5：CAF spheroid 的活力验证

该图为 CAF 单型 spheroid 的活死染色(7 天培养)：FDA(绿色，活细胞)覆盖大部分区域，PI(红色，死细胞)极少，且所有 CAF 均能形成致密 spheroid(直径约 200μm)。结果证实 CAF 可在 3D 环境中存活，为模拟肿瘤纤维化区域提供模型。

图6：缺氧激活 CAF 对乳腺癌转移的影响

该图为异质型 spheroid(CAF + 乳腺癌细胞)功能实验：a 图单型 spheroid(仅肿瘤细胞)无明显侵袭;b 图异质型 spheroid：BrC4f(S4)与肿瘤细胞形成局部聚集，BrC4f_Hyp2(缺氧激活)均匀分布，且 MDA-MB-231(三阴性)与 BrC4f_Hyp2 共培养时，星状突起(侵袭标志)最多;c 图迁移统计：MDA-MB-231/BrC4f_Hyp2 组迁移距离是单肿瘤细胞组的 4 倍、BrC4f 组的 1.5 倍。结果证实缺氧激活的 S4 亚型可显著增强三阴性乳腺癌的转移潜力。

研究结论

本研究成功建立了乳腺癌患者来源 CAF 培养体系，从 5 例患者组织中分离鉴定出 Costa 分类的 S1-S4 四种亚型，明确各亚型的分子表型(S1：FAP 高、免疫抑制;S4：αSMA 高、促转移;S2：标志物低表达、耐药)、药物敏感性(S4/S1 敏感、S2 耐药)及 3D 存活能力;进一步发现脉冲缺氧激活的 S4 亚型可通过增强细胞迁移侵袭，显著促进三阴性乳腺癌的转移潜力。该研究不仅提供了可复刻患者 TME 异质性的 CAF 实验工具，还揭示了 CAF 亚型与乳腺癌进展、药物耐药的关联，为针对不同 CAF 亚型的精准靶向治疗(如 S2 耐药亚型联合干预、S4 促转移亚型抑制)及 TME 模拟模型构建提供了关键实验依据。