GL261 Red-FLuc 和 TRP-mCherry-FLuc 小鼠胶质母细胞瘤的荧光引导切除术

荧光素酶报告基因系统是一种基于荧光素酶催化底物氧化反应产生生物发光的检测技术，广泛应用于细胞生物学研究。其中，萤火虫荧光素酶(firefly luciferase, Fluc)因其高灵敏度、宽线性检测范围(约7~8个数量级)以及较短的半衰期(在哺乳动物细胞中约为3小时，在植物细胞中约为3.5小时)而成为最常用的报告基因。其发光信号强度在酶浓度为10⁻¹⁶ mol/L至10⁻⁸ mol/L的范围内与酶活性呈线性关系，并且在理想条件下可检测到低至10⁻²⁰ mol/L的荧光素酶活性。此外，荧光素酶报告基因系统具有非放射性、检测快速、灵敏度高(比氯霉素乙酰转移酶CAT高100倍)等优点，特别适用于高通量筛选和活细胞检测。通过将荧光素酶报告基因载体转染至宿主细胞后，可利用荧光素酶检测系统灵敏且便捷地监测基因表达水平，已成为细胞生物学研究中的重要工具。

基本信息

英文标题：Fluorescence-Guided Resection of GL261 Red-FLuc and TRP-mCherry-FLuc Mouse Glioblastoma Tumors

中文标题：GL261 Red-FLuc 和 TRP-mCherry-FLuc 小鼠胶质母细胞瘤的荧光引导切除术

发表期刊：《Cancers》

影响因子：4.4

作者单位：

1.Department of Pharmaceutical Sciences, College of Pharmacy, University of Kentucky, Lexington, KY 40536, USA

2.Sanders-Brown Center on Aging, University of Kentucky, Lexington, KY 40536, USA

3.Department of Pharmacology and Nutritional Sciences, College of Medicine, University of Kentucky, Lexington, KY 40536, USA

作者信息：

Louis T. Rodgers¹、Bryan J. Maloney¹、Anika M. S. Hartz²,³、Björn Bauer¹,²

研究背景

胶质母细胞瘤(GBM)是成人最常见且侵袭性最强的原发性脑肿瘤，手术切除联合放化疗是标准治疗，但预临床研究多未纳入手术环节，导致研究结果与临床转化存在巨大差距。5 - 氨基乙酰丙酸(5-ALA)是 FDA 批准的临床荧光成像剂，可在 GBM 细胞内代谢生成原卟啉 IX(PpIX)，实现术中肿瘤边界可视化，提升切除程度和患者预后。现有预临床荧光引导切除协议依赖荧光标记细胞(缺乏临床相关性)、肿瘤植入深度浅(无法模拟人类肿瘤侵袭性)，且未评估生存结局。本研究开发并验证了基于 5-ALA 的预临床 GBM 切除协议，在两种小鼠模型中模拟临床场景，为辅助疗法评估和临床转化搭建桥梁。

研究方法

采用两种小鼠 GBM 模型：GL261 Red-FLuc(常用同基因模型)和 TRP-mCherry-FLuc(携带 RB、KRAS、PTEN 突变，模拟人类 GBM 表型)。细胞培养后，通过立体定向手术将 5000 个肿瘤细胞植入小鼠颅内 4 mm 深度(模拟深层肿瘤)。术前 2 小时腹腔注射 5-ALA(500 mg/kg)，术中通过荧光显微镜(激发 400-630 nm，发射 630-710 nm)识别 PpIX 荧光，采用颅骨开窗 + 活检取样 + 负压抽吸完成肿瘤切除，术后用硬脑膜替代物封闭颅骨窗口(闭合系统)。通过生物发光成像(GL261 模型)、T2 加权 MRI(TRP 模型)监测肿瘤生长;记录小鼠生存时间和体重变化;采用 Cox 生存模型和联合纵向 - 事件时间模型分析数据，P<0.05 为差异有统计学意义。

实验结果

图 1：5-ALA 代谢通路及荧光产生机制

该图阐明了 5-ALA 诱导荧光的核心原理：外源性 5-ALA 通过 PEPT1/2 转运蛋白进入细胞，经血红素生物合成通路代谢，最终生成原卟啉 IX(PPIX);PPIX 在肿瘤细胞中选择性积累(因酶和转运体表达差异、血脑屏障渗漏)，经 400-630 nm 光激发后，发射 630-710 nm 荧光，为术中肿瘤识别提供分子基础。这是荧光引导手术的核心理论支撑。

图 2：手术现场设备布置

展示了标准化的荧光引导切除手术设备组合，关键组件包括：1)真空收集器(抽吸残留肿瘤组织)、2)多波段 LED 光源(提供激发光)、3)带荧光滤镜的立体显微镜(识别 PPIX 荧光)、4)显微镜相机(记录手术过程)、6)立体定向框架(固定小鼠头部)、10)微型颅骨钻(创建颅骨窗口)。设备布局模拟临床手术场景，确保术中精准定位和荧光识别。

图 3：颅内肿瘤切除流程示意图

清晰呈现手术关键步骤：1)术前 2 小时给小鼠腹腔注射 5-ALA 和镇痛剂丁丙诺啡;2)麻醉后固定于立体定向框架，消毒手术区域;3)切开头皮，围绕原肿瘤接种位点创建颅骨窗口;4)用活检工具切除 2×3 mm 肿瘤组织，结合荧光显微镜识别残留荧光组织并抽吸清除;5)用硬脑膜替代物封闭颅骨窗口，伤口夹闭合头皮。该流程突出 “闭合系统” 设计，维持颅内压稳定，更贴近临床手术规范。

图 4：体外验证 5-ALA 诱导肿瘤细胞荧光

GL261 Red-FLuc 和 TRP-mCF 细胞经 1 mM 5-ALA 处理后，荧光强度(RFU)随时间显著升高，且与细胞接种密度正相关(25,000 细胞 / 孔荧光强度高于 12,500 细胞 / 孔)。GL261 细胞的荧光信号显著高于 TRP-mCF 细胞(P<0.001)，证实 5-ALA 可在两种肿瘤细胞中特异性产生荧光，为体内手术提供基础。

图 5：TRP-mCF 肿瘤切除延长小鼠生存并减缓体重下降

对照组、假手术组、切除组的中位生存期分别为 27 天、26 天、34 天，切除组生存显著延长(P<0.001);切除组体重下降速率(每日 - 0.32%)显著慢于对照组(每日 - 1.31%)和假手术组(每日 - 1.37%)(P<0.001)。切除后小鼠体重短暂下降，术后 3 天开始恢复，而假手术组无术后体重损失，证实手术的特异性获益。

图 6：GL261 Red-FLuc 肿瘤切除延长生存、减少体重损失并减慢肿瘤生长

切除组中位生存期(32 天)显著长于对照组(27 天)(P<0.001);切除组体重下降速率显著低于对照组(P<0.001);生物发光成像显示，切除组肿瘤复发生长速率显著慢于对照组，术后 1 天肿瘤生物发光平均降低 91.6%(P<0.001)。86% 的小鼠肿瘤切除率≥85%，67%≥95%，但切除程度与生存无显著相关性，推测近全切除后肿瘤生物学特性是生存的主要影响因素。

研究结论

本研究开发了临床相关性强的 5-ALA 荧光引导 GBM 切除预临床协议，核心优势包括：使用 FDA 批准的 5-ALA、靶向深层肿瘤(4 mm)、采用闭合手术系统(维持颅内压)、在两种表型不同的小鼠模型中验证。结果证实，该手术可显著延长 GL261 和 TRP-mCF 模型小鼠的生存期，减缓体重下降和肿瘤复发，填补了预临床模型与临床 GBM 治疗(手术 + 辅助治疗)的差距。该协议为评估术后辅助疗法(免疫治疗、靶向治疗)提供了更贴近临床的平台，有助于提升预临床研究的转化效率。