间充质干细胞来源外泌体通过抑制 Th17 分化减轻人肝多谱系类器官和 Mdr2-/- 小鼠的胆管周围纤维化研究

原发性硬化性胆管炎(PSC)是一种慢性肝病，以肝内胆管进行性炎症和纤维化为特征，典型表现为 “洋葱皮样” 胆管周围纤维化，终末期需肝移植，缺乏有效治疗手段。其发病与免疫失调、遗传因素及胆管病理密切相关，其中辅助性 T 细胞 17(Th17)及其分泌的 IL-17A 被认为是驱动纤维化的关键因素 ——IL-17A 可刺激胆管上皮分泌趋化因子(如 CCL20)，招募更多 Th17 细胞，形成促纤维化正反馈。间充质干细胞来源的外泌体(EVMSC)具有免疫调节和抗纤维化潜力，但其在 PSC 中的具体机制尚不明确。本研究通过人肝多谱系类器官(Mulorgs)和 Mdr2-/- 小鼠模型，探究 EVMSC 通过调控 Th17 分化减轻胆管周围纤维化的作用及机制。

来自浙江大学医学院附属第一医院的团队在《Journal of Nanobiotechnology》期刊发表了题为Mesenchymal stem cell-derived extracellular vesicles attenuate periductal fibrosis by inhibiting Th17 differentiation in human liver multilineage organoids and Mdr2−/− mice的研究。

核心内容如下：

研究模型：

建立含胆管细胞、肝细胞和肝星状细胞(HSCs)的人肝多谱系类器官(Mulorgs)，诱导为 IL-17A 驱动的纤维化类器官(FibHOs);

采用 Mdr2-/- 小鼠(PSC 模型)验证体内疗效。

关键机制：

EVMSC 富集 hsa-miR-7977，靶向 NFKBIZ(编码 IκBζ)，抑制其翻译，减少 IL-17A 及下游 Th17 分化、IL-17 信号通路相关基因表达;

抑制 Th17 细胞分化和迁移至胆管周围纤维化区域，降低肝内 IL-17A 水平，减少 HSCs 激活和胶原沉积。

主要结果：

EVMSC 在 Mdr2-/- 小鼠中富集于肝纤维化区域，降低肝重 / 体重比、血清转氨酶及纤维化相关基因(Col3a1、Acta2 等)表达;

显著减少小鼠肝内 IL-17A + 细胞数量，体外抑制 CD4+T 细胞向 Th17 分化(抑制率 25.07%);

FibHOs 中，EVMSC 降低 IL-8、CCL20 等炎症因子及 COL1A1 等纤维化标志物表达;

miR-7977 富集的 EVMSC(EVhigh)可改善 Mdr2-/- 小鼠胆管周围纤维化，减少纤维化区域 IL-17A + 细胞比例(降低 50.42%)。

实验结果

图 1：MSC 来源的 EVs 显著改善 Mdr2-/- 小鼠肝脏状况

内容：(A)EVMSC 表征：纳米颗粒追踪分析(NTA)显示其粒径分布(约 125.7nm)和浓度;冷冻电镜证实膜完整性;Western blot 检测到 TSG101、Hsp70、CD63 等 EV 标志物。(B)处理示意图：8 周龄 FVB.Mdr2 小鼠每周尾静脉注射 EVMSC，12 周龄分析，Mdr2+/+ 小鼠为对照。(C)EVMSC 生物分布：DiR 标记的 EVMSC(红色)在 Mdr2-/- 小鼠肝内富集，尤其在胆管周围和纤维化区域;共定位分析显示 EVMSC 与 Alb + 肝细胞、CK7 + 胆管细胞、α-SMA+HSCs 及 CD45 + 免疫细胞共定位(DAPI 染核)。(D)肝重 / 体重比：12 周龄 Mdr2-/-+EV 组显著低于 Mdr2-/- 组(n=5，P<0.05)。(E)肝组织 P21(细胞衰老标志物)表达：Mdr2-/-+EV 组显著降低(n=3)。(F)HE 染色显示 Mdr2-/-+EV 组汇管区纤维化改善。(G)SA-β-gal(衰老)和 CK19(胆管细胞)染色：Mdr2-/-+EV 组胆管衰老减轻。(H)血清转氨酶(AST、ALT、ALP)：Mdr2-/-+EV 组显著降低(n=5，P<0.05)。(I)Western blot 显示 Mdr2-/-+EV 组 cleaved-caspase-3/caspase-3、cleaved-caspase-9/caspase-9 比值降低。(J)肝组织及血清中 Ccl20、Ccl2 等细胞因子水平：Mdr2-/-+EV 组显著降低(n=5，P<0.05)。

图 2：EVMSC 减轻 Mdr2-/- 小鼠肝纤维化并抑制 Th17 分化

内容：(A)qRT-PCR 显示 Mdr2-/-+EV 组肝组织纤维化相关基因(Acta2、Col3a1 等)及血清 TGF-β1 水平显著降低(n=5，P<0.05)。(B)天狼星红染色(胶原)、α-SMA 免疫荧光(HSCs 激活)、Desmin 免疫组化(HSCs 标志物)：Mdr2-/-+EV 组阳性区域减少。(C)Image-Pro Plus 定量分析上述染色结果(n=15，P<0.05)。(D)KEGG 富集分析显示 Mdr2-/-+EV 组下调通路中 Th17 分化通路显著富集。(E)Th17 分化通路基因表达趋势：Mdr2-/- 组上调，Mdr2-/-+EV 组下调。(F)12 个 Th17 分化相关基因在 Mdr2-/- 组上调、Mdr2-/-+EV 组下调。(G)qRT-PCR 显示 Mdr2-/-+EV 组肝内免疫细胞 Il-17a mRNA 降低(n=10，P<0.05)。(H)IL-17A 免疫组化：Mdr2-/-+EV 组胆管周围 IL-17A + 细胞(红箭头)减少。(I)流式细胞术显示 EVMSC 体外抑制 CD4+IL17A+ T 细胞比例(2-15ng/mL 浓度下抑制率 16.5%-25.03%，n=9)。(J)qRT-PCR 显示 EVMSC 降低 Th17 细胞 IL-17A 表达(抑制率 15.56%，n=9，P<0.05)。

图 3：EVMSC 逆转 IL-17A 诱导的纤维化类器官(FibHOs)

内容：(A)Mulorgs 及 FibHOs 建立示意图：胆管细胞类器官(Chorgs)、肝细胞类器官(Heporgs)与 HSCs 共培养形成 Mulorgs，经 IL-17A 处理为 FibHOs。(B)免疫荧光显示 Mulorgs 中 Desmin+(红)和 GFAP+(绿)HSCs 分布(Z-stack 扫描)。(C)免疫荧光显示 Mulorgs 中 CK18 + 肝细胞(绿)、CK19 + 胆管细胞(红)、GFAP+HSCs(品红)的 3D 和 2D 分布(DAPI 染核)。(D)qRT-PCR 显示 IL-17A(250-400ng/mL)剂量依赖性上调 FibHOs 中 COL1A1、TGFB1 等纤维化基因(n=5，P<0.05)。(E)ELISA 及 LEGENDplex 检测显示 IL-17A 上调 FibHOs 分泌 IL-8、IL-6、CCL20 等(n=3-5，P<0.05)。(F)qRT-PCR 显示 EVMSC 下调 FibHOs 中 COL1A1 等纤维化基因(n=3，P<0.05)。(G)EVMSC 降低 FibHOs 分泌 IL-8、CCL20 等(n=3，P<0.05)。(H)3D 免疫荧光显示 EVMSC 处理后 FibHOs 中 α-SMA(绿)和胶原 I+III(红)减少(Dil 染膜，DAPI 染核)。(I)Masson 染色显示 EVMSC 处理组 FibHOs 胶原(蓝)减少。

图 4：EVMSC 来源的 miR-7977 靶向 NFKBIZ 抑制 Th17 分化

内容：(A)GO 富集分析显示 Mdr2-/- 与 Mdr2-/-+EV 组肝组织差异基因富集于转录调控相关功能。(B)EVMSC 中 miRNA 靶基因 GO 富集于 “RNA 诱导沉默复合体” 等通路。(C)EVMSC 中高表达的 6 种 miRNA(如 hsa-miR-7977)。(D)TargetScan 分析显示 hsa-miR-7977 靶向 Th17 分化相关转录因子数量最多。(E)hsa-miR-7977 与 NFKBIZ 3'UTR 结合序列示意图。(F)荧光素酶报告实验证实 hsa-miR-7977 与野生型(WT)NFKBIZ 3'UTR 结合，突变型(MUT)无结合(n=3，P<0.05)。

图 5：EV 来源的 miR-7977 通过减少 IκBζ 抑制 Th17 分化及 IL-17A 表达

内容：(A)流式细胞术显示 miR-7977 模拟物减少 CD4+IL-17A+ T 细胞比例(平均抑制率 31.12%，n=5，P<0.05)。(B)qRT-PCR 显示 EVMSC 或 miR-7977 模拟物下调 Th17 细胞中 NFKBIZ 表达(抑制率分别为 26.58%、30.32%，n=5，P<0.05)。(C)Western blot 显示 EVMSC 或 miR-7977 模拟物降低 IκBζ 蛋白水平(抑制率分别为 37.75%、52.09%)，升高 p-eIF2α/eIF2α 比值(n=5)。(D)qRT-PCR 显示 miR-7977 模拟物下调 IL-17A 表达(抑制率 50.66%，n=5，P<0.05)。(E)KEGG 分析显示 IκBζ 靶基因富集于 IL-17 信号、Th17 分化等通路。(F)ChIP-seq 显示 Th17miR 组(miR-7977 处理)IL-17A 基因峰减少。

图 6：EVhigh 有效改善 Mdr2-/- 小鼠胆管周围纤维化微环境

内容：(A)EVhigh(高 miR-7977)和 EVlow(低 miR-7977)的制备与表征：qRT-PCR 证实 miR-7977 水平，NTA 显示粒径和浓度(n=3-5，P<0.05)。(B)流式细胞术显示 EVhigh 抑制 Th17 分化(抑制率 25.07%，n=5，P<0.05)。(C)天狼星红和 Masson 染色显示 Mdr2-/-+EVhigh 组胶原沉积显著减少(n=5，P<0.05)。(D-E)CK19(胆管细胞)和 α-SMA(HSCs)免疫组化：Mdr2-/-+EVhigh 组阳性区域减少。(F)Image-Pro Plus 定量上述染色结果(n=30，P<0.05)。(G)qRT-PCR 显示 Mdr2-/-+EVhigh 组 Col3a1、Acta2 等纤维化基因下调(n=5，P<0.05)。

图 7：EVhigh 通过抑制 Th17 分化和迁移改善 PSC 的 Th17 相关纤维化微环境

内容：(A)IL-17A 免疫组化显示 Mdr2-/-+EVhigh 组纤维化区域 IL-17A + 细胞减少(虚线框为非纤维化区)。(B-C)纤维化及非纤维化区域 IL-17A + 细胞数量和比例定量(n=40，P<0.05)。(D)Mdr2-/-+EVhigh 组肝内 IL-17A + 细胞比例降低 50.42%，EVlow 组升高 17.88%(n=5，P<0.05)。(E)FibHOs 与 Th17 细胞共培养示意图。(F)光镜显示 Th17 细胞 3h 向 FibHOs 迁移、24h 聚集，Th17-EVhigh 组迁移减少;健康对照 FibHOs 与 Th17 共培养结构破坏，与 Th17-EVhigh 共培养形态保持;PSC 来源 FibHOs 与两者共培养形态变化小(比例尺 100μm)。

全文总结

本研究证实，间充质干细胞来源的外泌体(EVMSC)通过其富集的 hsa-miR-7977 靶向 NFKBIZ，抑制 IκBζ 翻译，从而减少 IL-17A 表达及 Th17 细胞分化与迁移，减轻 Mdr2-/- 小鼠和人肝多谱系类器官(Mulorgs)中的胆管周围纤维化。EVhigh(高 miR-7977)可显著降低纤维化相关基因表达、HSCs 激活及炎症因子水平，为原发性硬化性胆管炎(PSC)及 Th17 相关疾病提供了新的治疗靶点和策略。局限性包括单一动物模型及类器官微环境模拟不完全，未来需结合更多临床样本和复杂模型验证。