基于 DNA - 丝素蛋白水凝胶缓释系统的软骨类器官加速软骨再生研究

软骨修复是再生医学领域的重大挑战，骨关节炎(OA)作为常见的退行性关节疾病，影响全球超 5.95 亿人，导致关节软骨降解和残疾。现有修复策略(如微骨折、自体软骨移植)存在修复周期长、效果欠佳等局限，主要依赖内源性细胞募集和增殖，难以快速形成功能性软骨。软骨类器官(COs)作为源自干细胞或祖细胞的三维微型组织，能模拟天然软骨的结构和功能，无需依赖内源性细胞募集，有望缩短修复周期。本研究构建了基于 DNA - 丝素蛋白(DNA-SF)水凝胶缓释系统(DSRGT)的软骨类器官，旨在通过调控干细胞 chondrogenesis 分化，实现高效软骨再生。

来自上海大学、上海交通大学医学院新华医院的团队在《Military Medical Research》期刊发表了题为Accelerating cartilage regeneration with DNA-SF hydrogel sustained release system-based cartilage organoids的研究。

核心内容如下：

DSRGT 系统构建：

通过丙烯酸 - 聚乙二醇 - N - 羟基琥珀酰亚胺(AC-PEG-NHS)将葡萄糖胺(促进软骨基质合成)和 TD-198946(促进软骨分化)共价接枝到 RGD 修饰的 DNA-SF 水凝胶，形成双网络结构(DNA 超分子网络和 SF 网络)，实现药物缓释。

利用数字光处理(DLP)3D 生物打印技术，构建含骨髓间充质干细胞(BMSCs)的毫米级软骨类器官。

关键结果：

体外优化：4 周培养的软骨类器官 SOX9、II 型胶原(Col II)、聚集蛋白聚糖(ACAN)表达最高，I 型胶原(Col I)和 X 型胶原(Col X)表达最低，呈现最佳透明软骨表型;

体内修复：将 4 周类器官移植到大鼠关节软骨缺损模型，8 周内实现软骨修复，通过激活 MAPK 信号通路(p38、ERK、JNK 磷酸化)促进再生;

转录组分析：再生软骨的基因表达谱与健康软骨高度相似，富集胶原相关 ECM 组织和 MAPK 通路相关基因。

实验结果

图 1：DSRGT 的合成与表征

内容：(A)DSRGT 的合成机制示意图，显示通过 AC-PEG-NHS 将葡萄糖胺(Glu)和 TD-198946 共价接枝到 DNA-SF 水凝胶，形成双网络结构;(B)溶液经 UV 光(365nm)固化为凝胶的转变;(C-D)核磁共振(NMR)证实 Glu 和 TD-198946 的 PEG-AC 修饰(6ppm 附近双键峰);(E)傅里叶变换红外光谱(FTIR)显示各组水凝胶的特征峰(如 DSRGT 中 1090cm⁻¹ 处 Glu 相关峰和 970cm⁻¹ 处 TD-198946 芳香环峰);(F-G)DLP 打印的球形结构宏观和扫描电镜(FE-SEM)图像，显示均一多孔表面;(H-I)水凝胶内部多孔结构，孔隙率约 55-62%，孔径约 270-280μm;(J-K)流变学分析显示储能模量(G’)> 损耗模量(G’’)，具有剪切稀化特性，适合 3D 打印;(L-M)降解和溶胀曲线，6 周降解约 55%，20h 溶胀稳定在 346%;(N)药物释放曲线，Glu 和 TD-198946 28 天累计释放达 95%，实现缓释。

图 2：DSR、DSRG、DSRT 及 DSRGT 对 BMSCs 生物相容性和迁移能力的影响

内容：(A)实验示意图，展示通过 DLP 打印机构建含 BMSCs 的水凝胶球体，评估生物相容性、迁移能力及细胞铺展情况;(B)活死细胞染色定量分析，1、3、5 天各组活细胞比例均 > 75%，组间无显著差异，显示良好生物相容性;(C)CCK-8 检测结果，各组细胞增殖趋势一致，随培养时间增长活力上升，组间无显著差异;(D)划痕实验及定量分析，12 小时后 DSRGT 组细胞迁移率最高(55.09±1.08%)，显著高于 DSR 组，DSRT 组迁移率(38.82±1.60%)亦高于 DSR 组，提示 TD-198946 可促进细胞迁移。

图 3：DSR、DSRG、DSRT 及 DSRGT 对 BMSCs 软骨分化能力的影响

内容：(A)阿尔新蓝染色及定量，14 天时 DSRG 和 DSRGT 组染色最深，GAG 合成量显著高于其他组;(B)GAG 和 Col II 含量定量，14 天时 DSRG 和 DSRGT 组 GAG 含量最高，DSRT 和 DSRGT 组 Col II 含量最高;(C)qRT-PCR 结果，14 天时 DSRGT 组 ACAN、Col II、SOX9 mRNA 表达最高，Col I 和 Col X mRNA 表达最低;(D)Western blot 及定量，14 天时 DSRGT 组 ACAN、Col II、SOX9 蛋白表达水平显著高于其他组，证实其最强软骨分化促进作用。

图 4：不同培养时间的软骨类器官评估

内容：(A)2、4、6 周软骨类器官的宏观形态，随培养时间逐渐收缩;(B)HE 染色显示 4 周类器官表面细胞多层排列，6 周出现空泡;(C-D)阿尔新蓝和番红 O / 快绿染色显示 4 周类器官的糖胺聚糖(GAG)含量最高，染色最深;(E)免疫荧光显示 4 周类器官 Col II 和 ACAN 表达最高，Col I 和 Col X 表达最低，证实最佳透明软骨表型。

图 5：0、2、4、6 周软骨类器官中 BMSCs 的转录组分析

内容：(A)主成分分析(PCA)显示不同培养时间的基因表达谱差异显著，组内聚集良好;(B)火山图显示 2 周 vs 4 周差异基因数量最多(4886 个)，6 周时下调基因(1006 个)多于上调基因(779 个);(C)Venn 图显示 311 个基因在各阶段持续差异表达，1796 个基因在各时间点均与 0 周存在差异;(D)热图显示软骨生成相关基因(Sox9、Col2a1 等)在 4 周时上调最显著，纤维化(Col1a1)和肥大(Mmp13)相关基因在 6 周时高表达;(E)KEGG 富集分析显示 MAPK、PI3K-Akt 等通路在各阶段持续激活，TGF-β 通路 4 周后显著上调;(F)GO 富集及 STEM 分析显示 ECM 组织、SMAD 信号传导等功能随时间增强，4 周时活性氧代谢和细胞迁移相关功能达峰值。

图 6：体内软骨修复的宏观评估

内容：(A)实验设计示意图，包括假手术组、对照组(纤维蛋白胶覆盖)、DSRGT 组、软骨类器官(CO)组;(B)4 周和 8 周时股骨髁缺损部位的宏观图像，CO 组 8 周时表面光滑，与周围软骨整合良好;(C)ICRS 评分显示 CO 组 8 周评分最高(10.08±0.79)，显著高于对照组和 DSRGT 组;(D)原子力显微镜(AFM)显示 CO 组再生软骨表面粗糙度(Ra)与假手术组接近，显著低于其他组。

图 7：软骨再生机制的转录组分析

内容：(A)韦恩图显示 CO 组与健康软骨共享 80 个差异基因，与损伤软骨仅共享 20 个;(B-C)火山图显示 CO 组较损伤软骨上调 230 个基因、下调 93 个，较健康软骨上调 100 个、下调 78 个;(D)热图显示 CO 组软骨再生相关基因(如 Col2a1、Sox9)显著上调;(E-F)GO 和 KEGG 分析显示富集胶原 ECM 组织、MAPK 信号通路;(H)Western blot 证实 CO 组 p-p38、p-ERK、p-JNK 表达升高，激活 MAPK 通路;(I)热图显示 CO 组与健康软骨的再生相关基因表达模式接近。

全文总结

本研究开发了 DNA-SF 水凝胶缓释系统(DSRGT)，通过共价接枝葡萄糖胺和 TD-198946 实现药物可控释放，结合 DLP 3D 打印技术构建毫米级软骨类器官。体外实验表明，4 周培养的类器官具有最佳透明软骨表型;体内移植后，通过激活 MAPK 信号通路(p38、ERK、JNK 磷酸化)促进软骨再生，8 周内实现缺损修复，再生软骨的基因表达谱与健康软骨高度相似。该研究为软骨缺损修复提供了 “类器官 + 缓释材料” 的创新策略，克服了传统修复周期长、效果有限的问题。