麻风树碱通过下调 NF-κB 和上调凋亡抑制剂抑制胶质瘤细胞活力

Reporter THP1 Cell Line 细胞系是以 THP-1 为工具细胞，采用慢病毒感染的方式，构建稳定表达报告基因的细胞系，可用于检测信号通路转导。在被PMA、INF-α等刺激后，目标信号通路被激活，会启动下游特定基因的表达，这个表达过程会同时带动“报告基因”的表达。通过检测报告基因的信号强度，可以间接、定量、灵敏地衡量该信号通路的激活程度。

THP-1细胞本身来源于人单核细胞，可以分化为巨噬细胞样细胞，是研究先天免疫的经典模型。报告基因株的建立使其功能更强大。THP-1报告基因株是免疫学、炎症性疾病、药物研发等领域不可或缺的强大工具。它可以将一个复杂的、内在的生物学过程(信号通路激活/基因表达)转变为一个易于检测、可定量的物理信号(光或荧光)。这使得研究人员能够高通量地筛选药物，精确地量化免疫反应强度，直观地研究信号通路机制。

基本信息

英文标题：Inhibition of glioma cell viability by jatrophone via NF-κB down-regulation and apoptosis inhibitor up-regulation

中文标题：麻风树碱通过下调 NF-κB 和上调凋亡抑制剂抑制胶质瘤细胞活力

发表期刊：《Arch Med Sci》

影响因子：3.3

作者单位：

1.Postgraduate Training Base of Rocket Army Special Medical Center of Jinzhou Medical University, Jinzhou Medical University, Jinzhou, Liaoning, China

2.Department of Neurosurgery, Rocket Army Medical Center, Beijing, China

作者信息：

Lei Yuan¹、Fei Wang²、Ting Zhang²

研究背景

胶质母细胞瘤(GBM)是颅内恶性肿瘤中致死率最高的类型，占原发性脑肿瘤的 30% 以上，患者确诊后平均生存期仅 2 年。现有治疗(如替莫唑胺、NovoTTF-100A 系统)因单一靶点易被代偿激活，疗效有限，亟需开发多靶点化疗策略。天然产物因其多靶点作用优势，成为抗瘤药物研发热点。麻风树碱(jatrophone)是大戟科植物中的二萜类化合物，具有恶螺环核心结构，已被证实具有抗肿瘤、抗疟和抗炎活性，但对胶质母细胞瘤的作用及机制尚未明确。本研究旨在探究麻风树碱对 U87MG 和 A172 胶质瘤细胞的抑制作用，揭示其调控 NF-κB 通路和凋亡相关蛋白的分子机制，为胶质母细胞瘤治疗提供新候选药物。

研究方法

采用 U87MG、A172 胶质瘤细胞及原代星形胶质细胞(对照)，培养基为含 10% 新生牛血清的 DMEM，37℃、5% CO₂培养。实验分组为不同浓度麻风树碱(1.25-15 μM)处理组及对照组，处理时间 72 小时。通过 MTT 法检测细胞增殖活力;电镜观察细胞形态变化;Hoechst 33342 染色观察核凋亡特征;Annexin V-FITC/PI 流式细胞术定量凋亡率;免疫细胞化学检测 NF-κB p65 胞内表达;Western blot 分析 NF-κB p65、存活素(survivin)、XIAP、Bcl-2、Bax 及活化型 caspase-9/-3 的蛋白水平;核蛋白提取试剂盒分离核组分，检测 NF-κB 核转位;流式细胞术分析细胞周期分布。数据采用 SPSS 13.0 统计，Student’s t 检验或 ANOVA 分析差异，P<0.05 为有统计学意义。

实验结果

图 1：麻风树碱浓度依赖性抑制胶质瘤细胞增殖

MTT 结果显示，麻风树碱对 U87MG 和 A172 细胞增殖的抑制呈剂量和时间依赖性，对原代星形胶质细胞无明显影响。72 小时时，U87MG 的 IC₅₀为 4.8 μM，A172 的 IC₅₀为 3.8 μM;15 μM 麻风树碱可将 U87MG 和 A172 细胞增殖率分别降至 22.5±0.8% 和 18.6±0.4%(P<0.01)，证实其对胶质瘤细胞的特异性抑制作用。

图 2：麻风树碱诱导胶质瘤细胞凋亡的形态学变化

倒置显微镜观察显示，4.8 μM 麻风树碱处理 72 小时后，U87MG 和 A172 细胞出现皱缩、脱落和聚集等凋亡形态，原代星形胶质细胞无异常;Hoechst 33342 染色显示，胶质瘤细胞细胞核出现碎裂、固缩等凋亡特征，对照组无明显变化，初步证实凋亡诱导作用。

图 3：麻风树碱显著提高胶质瘤细胞凋亡率

Annexin V/PI 流式定量显示，4.8 μM 麻风树碱处理后，U87MG 细胞凋亡率从 1.89±0.2% 升至 49.5±2.3%，A172 细胞从 2.87±0.4% 升至 57.7±2.6%(P<0.02)，明确麻风树碱可有效诱导胶质瘤细胞凋亡。

图 4：麻风树碱阻滞胶质瘤细胞于 G1/G0 期

流式细胞周期分析显示，4.8 μM 麻风树碱处理后，U87MG 细胞 G1/G0 期比例从 65.34% 升至 82.23%，A172 细胞从 54.38% 升至 80.52%(P<0.05);S 期和 G2/M 期细胞比例显著下降，证实其通过阻滞细胞周期于 G1/G0 期抑制增殖。

图 5：麻风树碱下调 NF-κB 表达并抑制其核转位

免疫细胞化学显示，麻风树碱处理后，U87MG 细胞胞内 NF-κB p65 评分从 8.9±0.9 降至 2.6±0.4，A172 细胞从 8.0±0.8 降至 1.9±0.4(P<0.02);核 / 总 NF-κB p65 比值在 U87MG 细胞中从 61.2±2.8% 降至 11.3±0.9%，A172 细胞从 53.5±2.7% 降至 9.5±0.7%，表明麻风树碱可抑制 NF-κB 表达及核转位。

图 6：麻风树碱调控凋亡相关蛋白表达

Western blot 结果显示，麻风树碱处理后，胶质瘤细胞中抗凋亡蛋白 survivin、XIAP、Bcl-2 表达显著下调，促凋亡蛋白 Bax 表达显著上调，Bcl-2/Bax 比值降低;原代星形胶质细胞的 Bcl-2/Bax 比值无明显变化，证实其对正常脑细胞的安全性及对凋亡通路的特异性调控。

图 7：麻风树碱激活 caspase-9 和 caspase-3

Western blot 显示，4.8 μM 麻风树碱处理后，U87MG 和 A172 细胞中活化型 caspase-9 和 caspase-3(p11 片段)表达显著升高(P<0.05)，原代星形胶质细胞中无明显激活，表明麻风树碱通过内源性凋亡通路诱导胶质瘤细胞凋亡。

研究结论

本研究证实，麻风树碱对 U87MG 和 A172 胶质母细胞瘤细胞具有特异性抑制作用，对原代星形胶质细胞无毒性。其分子机制为：1)浓度依赖性抑制细胞增殖，诱导凋亡并阻滞细胞周期于 G1/G0 期;2)下调 NF-κB p65 表达及核转位，阻断促存活信号通路;3)抑制抗凋亡蛋白 survivin、XIAP、Bcl-2 表达，上调促凋亡蛋白 Bax 表达;4)激活 caspase-9 和 caspase-3，启动内源性凋亡通路。这些结果表明麻风树碱通过多靶点调控发挥抗胶质母细胞瘤作用，有望成为胶质母细胞瘤治疗的新型候选药物。