GOLM1 通过 EGFR 信号激活介导的 GOLM1-CSN5 正反馈环路调控肝癌乐伐替尼获得性耐药

检测细胞株广泛应用于药物发现、抗体开发、基因研究和毒性评估等领域。基于D-Luciferase的报告基因细胞株及其荧光素酶检测方法在药物初筛/复筛、表位竞争、药物生物活性检测等多方面展现了广泛的应用潜力。报告基因法已被药典收录，为国家认可的检测方法。报告基因细胞株多用于监测特定的生物过程或信号通路。

HEK293细胞因子报告基因细胞株是以HEK293为工具细胞，采用慢病毒感染的方式构建，不仅能够稳定表达细胞因子受体蛋白，并且能够表达荧光素酶报告基因，是基于转录因子信号通路构建的荧光素酶报告基因细胞系。当细胞因子结合受体蛋白后，细胞因子与受体蛋白相互作用，激活转录因子信号通路，从而激活荧光素酶的表达。荧光信号的强弱即代表信号通路的激活效果，因此可用于相关药物的体外效果评价，筛选抗体以及筛选信号通路的激活剂或抑制剂。

基本信息

英文标题：GOLM1 dictates acquired Lenvatinib resistance by a GOLM1-CSN5 positive feedback loop upon EGFR signaling activation in hepatocellular carcinoma

中文标题：GOLM1 通过 EGFR 信号激活介导的 GOLM1-CSN5 正反馈环路调控肝癌乐伐替尼获得性耐药

发表期刊：《Oncogene》

影响因子：7.3

作者单位：

1.Department of Liver Surgery and Transplantation, Liver Cancer Institute, Zhongshan Hospital, Fudan University, Key Laboratory of Carcinogenesis and Cancer Invasion, Ministry of Education, Shanghai 200032, PR China

2.Department of Thoracic Surgery, Zhongshan Hospital, Fudan University, Shanghai 200032, PR China

3.Department of Molecular Biology, Shanghai Sixth People’s Hospital Affiliated to Shanghai Jiao Tong University School of Medicine, Shanghai 200032, PR China

4.Department of General Surgery, Zhongshan Hospital, Fudan University, Shanghai 200032, PR China

5.Department of Pancreatic Surgery, Shanghai General Hospital, Shanghai Jiao Tong University School of Medicine, Shanghai 200080, PR China

6.Department of Thyroid Surgery, Second Affiliated Hospital of Nanchang University, Nanchang 330000, PR China

7.Shanghai Medical College and Zhongshan Hospital Immunotherapy Technology Translational Research Center, Shanghai 200031, PR China

作者信息：

Marc A. Egerman¹、Yuhong Zhang¹、Romain Donne¹、Jianing Xu¹、Abhilash Gadi¹、Corissa McEwen¹、Hunter Salmon¹、Kun Xiong²、Yu Bai²、Mary Germino³、Kevin Barringer⁴、Yasalp Jimenez⁴、Maria del Pilar Molina-Portela⁴、Tea Shavlakadze¹、David J. Glass¹*;通讯作者：David J. Glass(david.glass@regeneron.com)

研究背景

肝细胞癌(HCC)是全球第二大致癌相关死亡肿瘤，乐伐替尼作为多靶点酪氨酸激酶抑制剂(TKI)，是晚期 HCC 的一线治疗药物，但获得性耐药普遍存在，严重限制临床获益。高尔基体膜蛋白 1(GOLM1)作为 Ⅱ 型跨膜蛋白，已被证实参与 HCC 转移和免疫逃逸，其通过调控 EGFR/RTK 循环和 EGFR-STAT3 通路发挥促癌作用，但在乐伐替尼耐药中的功能及机制尚未明确。本研究旨在揭示 GOLM1 介导乐伐替尼耐药的分子机制，为改善 HCC 治疗效果提供新靶点和生物标志物。

研究方法

构建乐伐替尼耐药(LR)肝癌细胞系(Hep3B LR、PLC/PRF/5 LR)，通过 RNA-seq 筛选耐药相关基因;采用 CCK-8、克隆形成、Transwell、EMT 检测等验证 GOLM1 对肝癌细胞乐伐替尼耐药的影响;构建皮下移植瘤、原位移植瘤及肺转移动物模型，评估 GOLM1 在体内的耐药作用。通过 LC-MS/MS、Co-IP、GST pulldown 验证 GOLM1 与 CSN5 的相互作用;利用 ChIP、双荧光素酶报告实验明确 GOLM1 调控 CSN5 的转录机制;通过 CHX 脉冲追踪、泛素化实验探究 CSN5 对 GOLM1 的稳定作用。收集 59 例 HCC 患者样本(36 例应答者、23 例非应答者)，结合 IHC、Western blot、ELISA 检测 GOLM1 及通路分子的临床相关性;所有数据采用 GraphPad Prism 8.0 分析，P<0.05 为差异有统计学意义。

实验结果

图 1：GOLM1 在乐伐替尼耐药肝癌中高表达

CCK-8 实验显示，Hep3B LR 和 PLC/PRF/5 LR 细胞的乐伐替尼 IC₅₀值分别是野生型的 2.5 倍和 2.2 倍(P<0.001);RNA-seq 及 Western blot 证实，GOLM1 是耐药细胞中唯一显著上调的核心基因(Log₂FC>5，P<0.05)。临床样本分析显示，非应答者肿瘤组织中 GOLM1 的 mRNA 和蛋白水平显著高于应答者(P<0.001)，且血清 GOLM1 水平在非应答者中大幅升高(P<0.001)，提示 GOLM1 与乐伐替尼耐药密切相关。

图 2：GOLM1 过表达促进肝癌细胞体外乐伐替尼耐药

肝癌细胞系中，Hep3B、PLC/PRF/5 为 GOLM1 低表达细胞，HCCLM3、MHCC97H 为高表达细胞。过表达 GOLM1 可显著削弱乐伐替尼对肝癌细胞增殖(克隆形成率提升 2 倍以上)、迁移侵袭(Transwell 细胞数增加 1.5 倍)的抑制作用(P<0.01);乐伐替尼可诱导 E-cadherin 上调、Vimentin 下调，而 GOLM1 过表达可逆转该 EMT 表型(P<0.01)。敲低 GOLM1 则能增强耐药细胞对乐伐替尼的敏感性，促进细胞凋亡(凋亡率提升 30%)。

图 3：GOLM1 过表达诱导肝癌体内乐伐替尼耐药

皮下移植瘤模型中，GOLM1 过表达组的肿瘤体积和重量显著大于对照组(P<0.01)，乐伐替尼的抑瘤效果被完全抵消;原位移植瘤模型证实，GOLM1 过表达显著削弱乐伐替尼的抗肿瘤作用(肿瘤重量增加 1.8 倍，P<0.001);肺转移模型中，乐伐替尼可减少对照组肺转移结节数(减少 60%)，但对 GOLM1 过表达组无明显影响(P>0.05)，证实 GOLM1 在体内介导乐伐替尼耐药和肿瘤进展。

图 4：GOLM1 与 CSN5 直接结合并上调其表达

LC-MS/MS 筛选出 128 个 GOLM1 相互作用蛋白，其中 CSN5(COP9 信号体亚基 5)得分最高;Co-IP、免疫荧光及 GST pulldown 证实 GOLM1 与 CSN5 直接结合，且 GOLM1 的 5-12 结构域是结合关键区域。过表达 GOLM1 可显著上调 CSN5 的 mRNA 和蛋白水平(P<0.01)，而敲低 GOLM1 则下调 CSN5 表达;CSN5 过表达可逆转敲低 GOLM1 对肿瘤生长的抑制作用(P<0.01)，提示 CSN5 参与 GOLM1 介导的耐药。

图 5：GOLM1 通过 EGFR-STAT3 通路转录调控 CSN5

GOLM1 过表达可激活 EGFR-STAT3 通路，上调 EGFR、p-STAT3(Tyr705)及 CSN5 表达(P<0.01)，EGFR 抑制剂厄洛替尼或 STAT3 抑制剂 BP-1-102 可阻断 GOLM1 对 CSN5 的上调作用(P<0.01)。ChIP 及双荧光素酶报告实验证实，p-STAT3 可直接结合 CSN5 启动子的 - 1766~-1756(Site A)和 - 950~-940(Site B)区域，驱动 CSN5 转录;突变这两个结合位点可完全消除 STAT3 的转录激活作用(P<0.001)。

图 6：CSN5 通过去泛素化稳定 GOLM1 蛋白

CSN5 过表达可上调 GOLM1 蛋白水平(P<0.01)，但不影响其 mRNA 表达;CHX 脉冲追踪显示，敲低 CSN5 可缩短 GOLM1 的半衰期(从 6h 降至 3h，P<0.01);MG132(蛋白酶体抑制剂)处理可逆转敲低 CSN5 对 GOLM1 的下调作用(P<0.01)。泛素化实验证实，CSN5 过表达可减少 GOLM1 的泛素化修饰(P<0.01)，而敲低 CSN5 则增强其泛素化，表明 CSN5 通过去泛素化稳定 GOLM1。

图 7：敲低 GOLM1 与乐伐替尼协同抗肿瘤，GOLM1-EGFR-STAT3-CSN5 通路在临床样本中共激活

皮下和原位移植瘤模型中，敲低 GOLM1 与乐伐替尼联合治疗的抑瘤效果显著优于单独治疗(肿瘤体积减少 70%，P<0.001)。72 例 HCC 临床样本的 IHC 分析显示，GOLM1 与 EGFR、p-STAT3、CSN5 的表达呈显著正相关(r>0.58，P<0.001);非应答者样本中该通路分子的激活水平显著高于应答者(P<0.001)，证实该通路在乐伐替尼耐药中具有临床相关性。

研究结论

本研究首次揭示 GOLM1 通过形成 GOLM1-EGFR-STAT3-CSN5 正反馈环路介导肝癌乐伐替尼获得性耐药：GOLM1 过表达激活 EGFR-STAT3 通路，转录上调 CSN5;CSN5 通过去泛素化修饰稳定 GOLM1 蛋白，进一步放大通路激活，最终导致肿瘤细胞对乐伐替尼耐药、增殖侵袭能力增强。临床样本证实，GOLM1 在乐伐替尼非应答者中高表达，且与 EGFR-STAT3-CSN5 通路共激活相关。敲低 GOLM1 可显著增强乐伐替尼的抗肿瘤效果，提示 GOLM1 可作为乐伐替尼耐药的预测生物标志物和治疗靶点，为改善晚期 HCC 的临床疗效提供了新策略。