CFz9 优化配方问世，溶解度提升 3 倍，脑部成像更安全

在生物医学研究和药物开发领域，生物发光成像技术因其高信噪比而被广泛应用于细胞测定和动物成像研究。然而，传统的荧光素酶种类有限，限制了同时成像多个分子和细胞事件的能力。为了突破这一限制，科学家们开发了一种新型的ATP非依赖性荧光素酶——NanoLuc(NL)，它源自深海虾Oplophorus gracilirostris，并经过工程改造以增强蛋白质稳定性。NanoLuc作为一种小型(19 kDa)、高亮度的荧光素酶，其亮度是传统萤火虫或海肾荧光素酶的100倍，并且使用furimazine作为底物产生明亮的辉光型发光。NanoLuc的意义在于其为双报告基因生物发光分子成像提供了新的可能。它不仅可以在活体小鼠的表层和深层组织中成像，而且其生物发光随时间的变化可以用来定量肿瘤生长，甚至在少量血清中也能检测到分泌的NL。此外，NanoLuc与萤火虫荧光素酶的结合使用，为在完整细胞和活体小鼠中定量TGF-β信号传导的两个关键步骤提供了一种新型双荧光素酶成像策略，从而在正常生理、疾病和药物开发中扩展了信号转导的成像能力。NanoLuc的作用不仅体现在其高灵敏度和高稳定性上，它还具有更小的尺寸，这使得在标记细胞和蛋白质时对样本的侵入性更小，有助于保持细胞或组织的天然状态。NanoLuc的快速反应、低背景发光和多样灵活等特点，使其在生物学和医学研究中具有广泛的应用前景。因此，NanoLuc作为一种新的报告基因，不仅增强了我们对生物过程的理解和疾病机理的研究，而且在开发潜在治疗方法和疗法方面发挥了重要作用。

基本信息

英文标题：An optimized luciferin formulation for NanoLuc-based in vivo bioluminescence imaging

中文标题：一种用于 NanoLuc 基体内生物发光成像的优化荧光素配方

发表期刊：《Scientific Reports》

影响因子：3.9

作者单位：

1.Promega Corporation, San Luis Obispo, CA, USA

2.Department of Bioengineering, Stanford University, Stanford, CA, USA

3.Department of Nuclear Medicine, Zhongshan Hospital, Institute for Translational Brain Research, State Key Laboratory of Medical Neurobiology and MOE Frontiers Center for Brain Science, Fudan University, Shanghai, China

4.Promega Corporation, Madison, WI, USA

5.Department of Neurobiology, Stanford University, Stanford, CA, USA

6.Department of Chemical and Systems Biology, Stanford University, Stanford, CA, USA

7.Department of Pediatrics, Stanford University, Stanford, CA, USA

作者信息：

Chao Gao、Yan Wu、Connor Fitzgerald

研究背景

生物发光成像(BLI)是临床前研究中无创追踪细胞群体和生化事件的核心技术，NanoLuc 作为新型海洋荧光素酶，具有亮度高、无需 ATP、分子量小等优势，但配套底物(如呋咱嗪 Fz、头孢呋咱嗪 CFz)存在 solubility 低、稳定性差、毒性较高等问题。尤其是脑部成像需求下，现有底物需大量赋形剂(如 Poloxamer-407，P-407)才能溶解，反复给药易导致器官损伤;且缓冲液选择不当会加速底物氧化降解，限制使用灵活性。因此，本研究旨在优化 NanoLuc 底物配方，提升溶解度、稳定性并降低毒性，满足全身(尤其是脑部)长效成像需求。

研究方法

以 CFz 的氟代衍生物 CFz9 为核心底物，通过 850 nm 吸光度法检测其在 PBS 中的溶解度;系统筛选水、生理盐水、DPBS、Tris 等 10 余种缓冲液，采用 LC-MS 分析底物溶解度和纯度(评估稳定性);在 C57BL/6 小鼠中进行毒性测试，通过血液化学检测和组织病理学分析，评估低剂量(1.3 μmol)和高剂量(4.2 μmol)CFz9 配方(含 P-407 赋形剂)反复给药后的安全性;利用 Alb-cre(肝脏特异性)和 Camk2a-cre(脑部特异性)转基因小鼠，对比 CFz9 与商用底物 FFz 的体内成像亮度、动力学及稳定性(不同复溶后静置时间)，采用 Ami HT 成像系统采集数据并统计分析。

实验结果

图 1：CFz9 的溶解度显著优于 CFz

CFz9 是 CFz 的 C8 苄基环氟代衍生物，结构修饰后溶解度提升显著：在无赋形剂的 PBS 中，CFz9 的沉淀起始浓度是 CFz 的 3 倍以上(吸光度法验证，P<0.01);高剂量(4.2 μmol)CFz9 仅需 12 mg P-407 即可溶解，而 CFz 需 20 mg P-407，证实 CFz9 可减少赋形剂用量，为降低毒性奠定基础。

图 2：Tris(pH 8.0)是 CFz9 复溶的最优缓冲液

缓冲液筛选显示：DPBS(pH7.0)中 CFz9 2 小时内溶解度不足 50%，纯度降至 80% 以下;水和生理盐水虽能维持稳定性，但无缓冲能力;Tris 缓冲液的稳定性随 pH 升高而提升，其中 100 mM Tris(pH8.0)效果最优，CFz9 复溶后 6 小时内溶解度近乎无损失，纯度维持 90% 以上，24 小时后纯度仍达 80%，显著优于其他缓冲液(P<0.001)。

图 3：优化 CFz9 配方的体内毒性低

反复给药毒性测试显示：低剂量(1.3 μmol)CFz9 给药 5 次、高剂量(4.2 μmol)给药 3 次后，小鼠体重无显著下降(P>0.05);组织病理学分析显示心、肝、肾、脑等器官无明显损伤(HE 染色无异常);血液化学检测仅发现总胆固醇和甘油三酯轻微升高，且与 P-407 赋形剂相关，而非 CFz9 本身，证实配方安全性显著优于原有 CFz 配方。

图 4：CFz9 配方体内成像效果优异且稳定

肝脏成像中，CFz9 与商用底物 FFz 的峰值亮度无显著差异(P=0.98)，仅信号衰减略快(半衰期差异 <5 分钟);脑部成像中，CFz9 复溶后 6 小时内给药，成像亮度无显著下降(P>0.05)，24 小时后亮度降至初始值的 25%;证实该配方可满足即时使用及短期静置后的成像需求，脑内外成像性能均达商用水平。

研究结论

本研究成功开发了以 CFz9 为核心的优化 NanoLuc 底物配方：通过结构修饰提升溶解度，减少 P-407 赋形剂用量;筛选出 Tris(pH8.0)缓冲液，使底物复溶后稳定达 6 小时;高剂量反复给药无明显器官损伤，毒性显著降低。该配方在体内成像中，脑内外峰值亮度与商用 FFz 相当，且支持长效纵向成像，解决了传统底物溶解度低、稳定性差、毒性高的核心痛点。该优化配方为 NanoLuc-based BLI 技术在基础研究(如细胞追踪、基因表达监测)和临床前药物研发中的广泛应用提供了实用工具，尤其适用于脑部等敏感组织的无创成像。