全球首个转基因非人灵长类模型问世，肝脏表达 hNTCP 赋予 HBV 易感性

乙肝病毒(HBV)感染是全球主要公共卫生问题之一，有超过2.5亿人慢性感染HBV。而其中有超三分之一的人口集中在我国，人数接近1亿人。NTCP工具细胞，特别是外源表达NTCP的肝癌细胞系如HepG2-NTCP和Huh7-NTCP，因其易操作、短周期、重现性佳的特点，在乙肝病毒(HBV)研究中扮演着至关重要的角色。这些细胞模型能够有效模拟HBV的感染过程，为研究HBV的生命周期、宿主限制因子、病毒复制以及药物筛选提供了一个强大而便捷的体外平台。它们不仅有助于揭示HBV感染的分子机制，如DDX3作为宿主限制因子阻碍cccDNA转录，GPC5作为附着因子在感染入胞过程中的作用，还能通过直接与NTCP相互作用或下调NTCP表达来筛选和验证抗病毒药物的活性，例如环孢菌素A及其衍生物、雷帕霉素及其衍生物等。此外，这些工具细胞还促进了对HBV宿主特异性分子的发现，为发展支持HBV感染的小动物模型提供了可能，这对于乙肝相关研究和药物开发具有重大意义。

基本信息

英文标题：Liver-specific transgenic expression of human NTCP in rhesus macaques confers HBV susceptibility on primary hepatocytes

中文标题：恒河猴肝脏特异性转基因表达人 NTCP 赋予原代肝细胞 HBV 易感性

发表期刊：《PNAS》

影响因子：9.1

作者单位：

1.Division of Pathobiology and Immunology, Oregon National Primate Research Center, Oregon Health and Science University, Beaverton, OR 97006, USA

2.Institute of Virology, Technical University of Munich/Helmholtz Munich, Munich 81675, Germany

3.German Center for Infection Research, Munich Partner Site, Munich 81675, Germany

4.Division of Reproductive and Developmental Sciences, Oregon National Primate Research Center, Oregon Health and Science University, Beaverton, OR 97006, USA

5.Division of Comparative Medicine, Oregon National Primate Research Center, Oregon Health and Science University, Beaverton, OR 97006, USA

6.Division of Genetics, Oregon National Primate Research Center, Oregon Health and Science University, Beaverton, OR 97006, USA

7.Division of Metabolic Health and Disease, Oregon National Primate Research Center, Oregon Health and Science University, Beaverton, OR 97006, USA

作者信息：

Lauren N. Rusta¹、Spandana Naldigaa¹、Brayden J. Hinrichsa¹

研究背景

乙型肝炎病毒(HBV)具有严格的物种特异性，缺乏免疫功能完整的非人灵长类预临床模型严重阻碍了治愈性疗法的研发。人钠 - 牛磺胆酸共转运多肽(hNTCP)是 HBV 入侵肝细胞的关键受体，恒河猴因 NTCP 氨基酸差异对 HBV 不敏感。此前通过腺病毒介导 hNTCP 表达可使恒河猴感染 HBV，但存在免疫原性强、表达短暂、转导效率有限等缺陷。因此，本研究利用 PiggyBac 转座子技术构建肝脏特异性 hNTCP 转基因恒河猴，旨在建立首个感染性疾病相关的转基因非人灵长类模型，为 HBV 病理机制研究和疗法验证提供理想工具。

研究方法

通过 PiggyBac 转座子技术构建含肝细胞特异性运甲状腺素蛋白(TTR)启动子的 hNTCP 表达载体(含核心绝缘子、WPRE 元件和多聚腺苷酸信号)。采用体外受精(IVF)获得恒河猴受精卵，显微注射转座子质粒与 PiggyBac mRNA，胚胎培养至桑椹胚 / 囊胚阶段后移植到代孕母猴。对新生猴进行 hNTCP DNA/RNA 定量(qPCR)、整合位点分析(esTag-PCR 和 Sanger 测序);通过 MyrB-ICG 荧光成像验证 hNTCP 体内结合活性;腹腔镜肝部分切除获取原代肝细胞(PH)，分别用 HBV-NanoLuc 报告病毒和野生型 HBV 感染，检测发光信号、HBsAg/HBeAg 分泌及病毒核酸，评估感染性;所有数据经统计学分析，结合组织学和血清学检测验证动物健康状况。

实验结果

图 1：hNTCP 转基因恒河猴的构建与生成

该图展示了 PiggyBac 转座子载体结构(TTR 启动子驱动 hNTCP 表达)、IVF - 胚胎注射 - 移植的技术流程，以及两只转基因猴(Tauro、Cholie)的鉴定结果。qPCR 显示 Tauro 和 Cholie 血液中存在 hNTCP DNA，而非转基因猴无;两只猴均健康存活，证实通过转座子介导的胚胎编辑成功生成肝脏特异性 hNTCP 转基因恒河猴，为后续功能验证奠定基础。

图 2：hNTCP 在多组织中的整合与表达特异性

该图检测了转基因猴肝脏、皮肤、淋巴结等多组织的 hNTCP DNA 整合和 RNA 表达。结果显示，Tauro 和 Cholie 的所有组织均检测到 hNTCP DNA 整合，但仅肝脏中 hNTCP RNA 高表达，水平与人类原代肝细胞(PH)相当;非转基因猴无 hNTCP 表达，证实 TTR 启动子介导的肝脏特异性表达，且转座子整合实现了全组织基因组插入但仅肝脏功能性转录。

图 3：hNTCP 在体内与 HBV Pre-S1 的结合验证

通过静脉注射 MyrB-ICG(HBV Pre-S1 衍生肽偶联荧光素)，腹腔镜荧光成像显示，Tauro 和 Cholie 的肝脏出现弥漫性荧光信号，分别是对照猴的 6.02 倍和 10.15 倍;胆囊因 ICG 胆汁清除出现荧光堆积，进一步证实转基因猴肝脏表达的 hNTCP 可在体内特异性结合 HBV Pre-S1，满足 HBV 入侵的关键受体功能。

图 4：转基因猴原代肝细胞的 HBV 感染验证

该图通过三类实验证实 Tauro 的 PH 对 HBV 易感：一是 HBV-NanoLuc 感染后，发光信号在 5 天达峰值(加 PEG 时 1059 倍高于基线，不加 PEG 时 24 倍)，MyrB 预处理可阻断感染;二是野生型 HBV 感染后，上清中检测到 HBsAg/HBeAg，非转基因猴 PH 无;三是细胞内检测到 HBV DNA 和 RNA，MyrB 可显著抑制病毒 RNA(降低 10,000 倍)，证实 hNTCP 介导的 HBV 完整生命周期(入侵、复制、抗原分泌)，且感染依赖 hNTCP-Pre-S1 结合。

研究结论

本研究首次利用 PiggyBac 转座子技术成功生成肝脏特异性表达 hNTCP 的转基因恒河猴，这是首个感染性疾病相关的转基因非人灵长类模型。该模型解决了 HBV 物种特异性导致的预临床模型缺口：hNTCP 在肝脏特异性高表达，可体内结合 HBV Pre-S1，原代肝细胞对报告病毒和野生型 HBV 均易感，且动物健康无明显异常。相比腺病毒介导的瞬时表达，转基因模型避免了免疫原性、表达短暂等缺陷，为 HBV 发病机制研究、垂直传播模拟及治愈性疗法(如 cccDNA 清除剂)的临床前验证提供了免疫功能完整的理想模型，有望加速 HBV 治愈性药物的研发进程。