miR-30 对结核分枝杆菌诱导的 THP-1 细胞 TLR/MyD88 信号通路的免疫调控作用

Reporter THP1 Cell Line 细胞系是以 THP-1 为工具细胞，采用慢病毒感染的方式，构建稳定表达报告基因的细胞系，可用于检测信号通路转导。在被PMA、INF-α等刺激后，目标信号通路被激活，会启动下游特定基因的表达，这个表达过程会同时带动“报告基因”的表达。通过检测报告基因的信号强度，可以间接、定量、灵敏地衡量该信号通路的激活程度。

THP-1细胞本身来源于人单核细胞，可以分化为巨噬细胞样细胞，是研究先天免疫的经典模型。报告基因株的建立使其功能更强大。THP-1报告基因株是免疫学、炎症性疾病、药物研发等领域不可或缺的强大工具。它可以将一个复杂的、内在的生物学过程(信号通路激活/基因表达)转变为一个易于检测、可定量的物理信号(光或荧光)。这使得研究人员能够高通量地筛选药物，精确地量化免疫反应强度，直观地研究信号通路机制。

基本信息

英文标题：Immune regulation of miR‑30 on the Mycobacterium tuberculosis‑induced TLR/MyD88 signaling pathway in THP‑1 cells

中文标题：miR-30 对结核分枝杆菌诱导的 THP-1 细胞 TLR/MyD88 信号通路的免疫调控作用

发表期刊：《Experimental and Therapeutic Medicine》

影响因子：2.3

作者单位：

Department of Tuberculosis, Jiangxi Province Chest Hospital, Nanchang, Jiangxi 330006, P.R. China

作者信息：

YUQING WU、QI SUN、LIANG DAI;通讯作者：Liang Dai(dai_brighten@126.com)

研究背景

结核分枝杆菌(MTB)感染引发的结核病是全球重大传染性疾病，感染机制复杂且耐药问题突出，现有卡介苗(BCG)对成人肺结核保护效果有限，亟需探索新型免疫调控靶点。微小 RNA(miRNA)在免疫反应的转录后调控中发挥关键作用，已有研究提示 miR-30 家族可能参与 MTB 感染过程，但具体成员的表达变化及对 MTB 诱导的 Toll 样受体(TLR)/ 髓样分化因子 88(MyD88)信号通路(该通路是 MTB 感染后炎症反应的核心通路)的调控机制尚不明确。因此，本研究旨在探究 MTB 感染 THP-1 细胞后 miR-30 家族成员的表达特征，以及其对 TLR/MyD88 通路激活和细胞因子分泌的调控作用，为结核病的治疗提供新的分子靶点。

研究方法

THP-1 细胞经 MTB H37Rv 菌株感染(感染复数 MOI=1:10)，分别在 0、6、12、24 小时通过 RT-qPCR 检测 miR-30 家族(a、b、c、d、e)的表达水平;将 miR-30a 模拟物、miR-30e 模拟物及阴性对照(miR-NC)通过 Lipofectamine® 2000 转染至 THP-1 细胞，感染 MTB 24 小时后，Western blot 检测 TLR2、TLR4、MyD88 蛋白表达，ELISA 法检测细胞上清中 TNF-α、IL-6、IL-8 的分泌水平;利用 miRanda 软件预测 miR-30a 的靶基因，构建 MyD88 3' 非编码区(3'UTR)野生型和突变型荧光素酶报告质粒，与 miR-30a 模拟物共转染 HEK293 细胞，通过双荧光素酶报告实验验证直接结合关系;所有数据采用 SPSS 19.0 软件分析，两组比较用 Student’s t 检验，多组比较用单因素方差分析，P<0.05 为差异有统计学意义。

实验结果

图 1：MTB 感染对 THP-1 细胞 miR-30 家族成员表达的影响

RT-qPCR 结果显示，MTB H37Rv 感染 THP-1 细胞后，miR-30a 和 miR-30e 的表达呈时间依赖性显著升高，在感染 6、12、24 小时均显著高于未感染组(P<0.05);而 miR-30b、miR-30c、miR-30d 的表达在感染前后无明显变化，提示 miR-30a 和 miR-30e 可能特异性参与 MTB 感染介导的免疫反应调控。

图 2：miR-30a 和 miR-30e 模拟物的转染效率验证

转染 miR-30a 模拟物后，THP-1 细胞中 miR-30a 的相对表达量较阴性对照(miR-NC)显著升高(P<0.01)，且感染 MTB 后仍维持高表达水平(P<0.01 vs. MTB 感染组);同理，miR-30e 模拟物转染后，细胞中 miR-30e 表达也显著上调(P<0.01)，证实模拟物转染有效，可用于后续功能实验。

图 3：miR-30a 和 miR-30e 对 TLR2、TLR4、MyD88 蛋白表达的影响

Western blot 结果显示，MTB 感染组 THP-1 细胞中 TLR2、TLR4、MyD88 蛋白表达均显著高于未感染对照组(P<0.05);转染 miR-30a 模拟物后，无论是否感染 MTB，这三种蛋白的表达均显著下调(P<0.05 vs. 对照组或 MTB 感染组);而转染 miR-30e 模拟物对 TLR2、TLR4、MyD88 的表达无显著影响，表明 miR-30a 可特异性抑制 MTB 诱导的 TLR/MyD88 通路关键分子表达。

图 4：miR-30a 和 miR-30e 对 TNF-α、IL-6、IL-8 分泌的影响

ELISA 结果显示，MTB 感染后 THP-1 细胞分泌 TNF-α、IL-6、IL-8 的水平显著升高(P<0.01 vs. 对照组);转染 miR-30a 模拟物可显著抑制感染组和未感染组的三种细胞因子分泌(P<0.05 或 P<0.01);而 miR-30e 模拟物转染后，细胞因子水平无明显变化，说明 miR-30a 可通过调控 TLR/MyD88 通路抑制炎症因子释放。

图 5：MyD88 是 miR-30a 的直接靶基因

miRanda 软件预测显示 MyD88 3'UTR 存在 miR-30a 的潜在结合位点;荧光素酶报告实验证实，miR-30a 模拟物可显著抑制野生型 MyD88 3'UTR 的荧光素酶活性(P<0.01 vs. miR-NC 组)，但对突变型 MyD88 3'UTR 的荧光素酶活性无影响，直接证明 miR-30a 可通过结合 MyD88 的 3'UTR 调控其表达。

研究结论

本研究首次证实，结核分枝杆菌(MTB)H37Rv 感染可时间依赖性诱导 THP-1 细胞中 miR-30a 和 miR-30e 的表达，其中仅 miR-30a 具有免疫调控功能：通过直接靶向 MyD88 的 3'UTR 抑制其表达，进而下调 TLR2、TLR4 的蛋白水平，阻断 TLR/MyD88 信号通路激活，最终减少 TNF-α、IL-6、IL-8 等促炎细胞因子的分泌，而 miR-30e 无此调控作用。该研究揭示了 miR-30a 在 MTB 感染免疫反应中的负向调控机制，为理解结核病的免疫病理过程提供了新视角，也为开发以 miR-30a 或 MyD88 为靶点的新型抗结核治疗策略奠定了实验基础。